Способ определения протеолитической активности молока
1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТЕОЛИТЙЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МОЛОКА, предусматривающий обезжиривание молока. добавление специфического субстрата с последующим гидролизом его в присутствии буфера и оценкой степени гидролиза флюориметрически, о т л и ч а ющ и и с я тем, что, с целью повьшения чувствительности способа, перед добавлением специфического субстрата из молока вьзделяют казеиновую фракцию, специфический субстрат вводят в обез жиренное молоко и в казеиновую фракцию , а определение протеолитической активности осуществляют в молоке и казеиновой фракции, при этом при определении протеолитической активности в молоке в качестве специфического субстрата используют карбоксибензоил-аргинин-7-аминокумарин солянокислый, W а в. казеиновой фракции - иммобилизованный на сефарозе 4В казеин, меченый с флюорескамином.. 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и и с я тем, что гидролиз проводят в присутствии буфера трис-НС8 0,2М, рН 8,0 - 8,5 в течение 18-22 ч. ND t О Од Ю
„„SU„„3 124032 А
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
«««
РЕСПУБЛИН з р С 12 М 9/00 ° С 12 Н 9 0!
ФЮ««, „ .« ° -,- .З
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ, . и АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ ССОР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТ РЫЫИИЙ (21) 3625375/30-15 (22) 15.07. 83 (46) 15;11.84. Бюл. Ф 42 (72) В.Ф.Поляков, Л.Д.Румш и О.N.Àäaìoâa .(71) Всесоюзный ордена Ленина научноисследовательский институт экспериментальной ветеринарии им.Я.Р.Коваленко (53) 637.127.6:577. 15.08(088.8) (56) 1. Kimmerman М., Ashe В., Jureviez Е.С. and Patel I. Sensitive аазауз for trvpsin, elastase and
chymotrypsin using nen fluorogenic
substrates.-"Àïà1ótiñà1 Biochemistry", 1977, 78, В 1, 47-51.
2. Keimerdes von Е.Н., Halpaap J.
und Klostermeyer М. Nilchproteinasen. .Vergleichende charakterisierung von
plasmin aus rinderblut mit е пег se-, rinproteinase.. aus kuhmilch.-"Ìi1cÛs senschaft",, 1981, Зб, У 1, 19-22. (54)(57) 1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МОЛОКА, предусматривающий обезжиривание молока, добавление. специфического субстрата с последующим гидролизом его в присутствии буфера и оценкой степени гидролиза флюориметрически, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, перед добавлением специфического субстрата из молока выделяют казеиновую фракцию, специфический субстрат вводят в обезжиренное молоко и в казеиновую фракцию,-а определение протеолнтической активности осуществляют в молоке и казеиновой фракции, при этом при определении протеолитической активности в молоке в качестве специфического субстрата используют карбоксибензоил- Е
-аргинин-7-аминокумарин солянокислый, а в. казеиновой фракции — иммобилизованный на сефарозе 4В казеин, меченый флюорескамином.
2. Способ по и. ), о т л и ч а юшийся тем, что гидролиз проводят в присутствии буфера .. трис -HCt 0,2М, рН 8 0 - 8 5 в течение 18-22 ч.
Э Ф
10
4О 1 1124
Изобретение относится к биохимии сельскохозяйственных животных, в частности к способам определения активности протеолитических ферментов молозива и молока для оптимизации рационов в кормлении телят раннего онтогенеза.
Участие ферментов молозива и молока в процессах пищеварения телят в первые часы и дни их жизни весьма актуально, так как их развитие и рост зависят от качества этих продуктов, используемых в качестве основных пищевых субстратов.
Известен способ определения активности сериновых протеиназ в тканевых гомогенатах, основанный на расщеплении специфического флюоресцентного субстрата карбоксибензоил-7-аминокумарина солянокис2О лого с последующим учетом результатов по степени образования 7-аминокумарина (1 ).
Однако этот способ не пригоден для определения протеолитической активности молока, Известен способ определения протеолитической активности молока, основанный на расщеплении специфических субстратов — бензоил-лизин- пмРм-нит«ЗО роанилида и бенэоил-аргинин- пара -нитроаиилида, протеазами молока, по степени образования нитроанилина f2)
Однако известный способ имеет низкую чувствительность и не позволяет определять активность фермента в молозиве.
Унифицированного способа определения протеолитической активности в молозиве и в молоке в мировой.практике нет.
032 2 ванный на сефарозе 4В каэеин, меченый флюорескамином.
Гидролиз проводят в присутствии буфера трис -HC0 0,2М, рН 8,0-8,5 в течение 18-22 ч.
Сущность предложенного способа состоит в следующем.
Для определения протеолитической активности в образцах свежевыдоенное молоко и молозиво обезжиривают, центрифугируя 500-1000 об/мин 20-25 мин при 0-4 С.
Далее готовят 0,4М раствор карбоксибензоил-аргинин-7-аминокумарина в 0,2М тФис -HCf буфере, который готовят в день определения.
Затем к 2,0-2,5 мл обезжиренного молока прибавляют 2,0-2,5 мл раствора карбоксибензаил-аргинин-7-аминокумарина. Гидролиз проводят в стерильных условиях или с использованием бактерицидных агентов (толуол, хлороформ, неомицин и др.).
Параллельно ставят контрольную пробу, для этого в две пробирки отдельно берут по 2,0-2,5 мл молока и 2,0-2,5 мл раствора субстрата.
Образцы и контрольную пробу инкубируют 18-22 ч при 37 С. Гидролиз останавливают подкислением реакционной среды до рН 3,5-4,0 ледяной уксусной кислотой. Осадок, образующийся после денатурации белков молока, отделяют центрифугированием при 20003000 об/мин 10-15 мин или фильтрованием. В прозрачном супернатанте определяют флюоресценцко на Флюориметре типа "Хитачи". Активация и эмиссия растворов образцов 380 и 440 нм соответственно.
При определении связанной с мицелЦель изобретения — повьпнение чувствительности способа, определения активности фермента во фракциях молока.
Поставле:ная цель достигается тем,45 что согласно известному способу перед добавлением специфического субстрата из молока выделяют казеиновую фракцию, специфический субстрат вводят в обезжиренное молоко и в каэеиновую фрак- 5О цию, а определение протеолитической активности осуществляют в молоке и каэеиновой фракции, при этом при определении протеолитической активности в молоке в качестве специфического 55 субстрата используют карбоксибенэоиларгинин-7-аминокумарин солянокислый, а в казеиновой фракции — юкмобилиэолами казеина протеиназы в качестве субстрата используют иммобилизованный на сефарозе 4В казеин, меченый флюорескамином., Для активирования сефарозы 4В
30,0-30,5 г сефарозы суспенэируют в
30,0 — 30,5 мл 2М раствора Na CO и помещают в ледяную баню. К суспензии сефарозы добавляют растворенного
5,0-4,5 г BrCN в 3,0 — 3,3 мл ацетонитрила. Реакцию активирования проводят при 1 — 40С и рН строго 11 О.
Значение рН во время реакции подцерживают 8 í. NaGH. По окончании реакции смесь помещают на стеклянный
Фильтр и быстро промывают л охлажденной до +4 — +10 С дистиллированной воды, затем трехкратнчм объемом холод11240
3 ного 0,2 М боратноуглекислонатриевого буфера (рН 10,0 — 10,5).
Сразу же после активации добавляют раствор лиганда — 4,5 — 5,0Х-ный раствор казенка. Реакцию проводят в течение 16-20 ч при 4 С при постоянном о 5 медленном помешивании, чтобы не повредить частицы геля. После пришивания лиганда казеин -сефароэу отмывают на стеклянном фильтре большим количеством дистиллированной воды, тремя . объемами 2М трис-НС8 буфера рН 8,08,1. Осадок казеин-.сефарозы суспензируют в трех объемах 2М трис -НС(буфера и оставляют при комнатной температуре 1,5 — 2 ч для блокирования открытых реакционных групп сефарозы.
После этого суспензйю повторно промы- вают на фильтре большим количеством дистиллированной воды и двумя объемами 0,1 М боратноуглекислонатриевого буфера рН 7,9 . — 8,0.
Казеин-сефарозу 4В суспензируют в равном объеме 0,2 М трис-НС0 буфера рН 7,9 — 8,0 и сохраняют при +4 С.
Препарат стабилен в. течение шести
25 месяцев.
Непосредственно перед анализом казеин-сефарозу 4В метят флюорескамином. Для этого к суспензии сефароэы добавляют 0,1. объем (Ч(Ч) 0,1
0,15Х-ного раствора флюорескамина в ацетоне. Для удаления излишков флюорескамина суспензию промывают на стеклянном фильтре 20 объемами
0,2 М трис -НСИ буфера рН 8,0-8,1. 35
В таком виде препарат готов для использования в качестве субстрата.
Для получения фракции казеина к образцу свежевыдоенного обезжиренного молозива или молока по кап- 4о лям прибавляют 1 н. НС . по достижению рН 4,60 — 4,66. Затем пробу молока оставляют при комнатной температуре 1,0-1,5 ч для отделения сыворотки и центрифугируют при 1500 — 45
2000 об!мин 10-15 мин. Сыворотку сливают, а осадок используют для определения активности протеиназы, связанной с мицеллами казеина. Для этого к 1,0-2,0 г каэеина добавляют; 50
2,0-2,5 мл казеин — сефарозы 4В.мече-„ ной флюорескамином, и 1,0 — 2, 0 мл
0,2 М трис -НС9 буфера рН 8,0-8,1.
Стеклянной палочкой аккуратно перемешивают всю реакционную смесь. 55
Гидролиз проводят 18-22 ч при
37 — 38 С в стерильных условиях. После инкубации для получения прозрачных растворов и остановки гидролиза образцы центрифугируют при 3500—
4000 об/мин 20-25 мин при Π— +4оС.
В прозрачном супернатанте измеряют флюоресценцию на флюорнметре типа "Хитачи". Активация и эмиссия раствора 390 и 475 нм соответственно.
Для расчета активности протеолитического фермента молока строят калибровочную кривую по значениям фюпооресценции растворов, полученных при гицролизе субстрата возрастающими
% количествами чистого препарата трипсина.
В табл. 1 показано влияние условий реакции гидролиза КБЗ-аргинин-7-аминокумарина на активность протеиназы молока коров (в трипсина) .
В табл. 2 показано влияние условий: реакции гидролиза, нммобилизованного, на сефарозе 4В казеика, меченого флюорескамином, на активность казеисвязанной протеиназы B молозиве коров через 24 ч. после отела.
Предлагаемый способ апробирован на двух группах коров черно-пестрой породы 3-4 отела на 7 головах в зимний (группа I) и на 5 головах в летний стойловый периоды (группа 0), живым весом 450 — 550 кг, продуктивностью в предыдущую лактацию 4000-4500 кг.
Животных ссдержали на общехозяйственном рационе, сбалансированном по основным питательным веществам.Образцы проб молозива и молока отбирали по схеме:через 1,3,5,7,8,15 и 24 ч после отела; далее в течение последующих шести дней составляли среднесуточную пробу от трех удоев, а затем до 60 дня лакта-. ции — подекадную среднесуточную пробу.
Полученные данные представлены в табл. 3.
Протеолитическая активность молозива коров, содержащихся на летнем рационе, уже через час после отела приблизительно на 707 выше, чем активность фермента в молозиве коров, содержашихся на зимнем рационе.. В дальнейшем содержание протеаэы в молозиве постепенно увеличивалось. Так через 5 ч после отела протеолитическая активность молозива коров, содержащихся на летнем рационе, возросла незначительно, а в молозиве коров, содержащихся на зимнем рационе, возросла на 6ОХ.
К концу первых суток активность протеолитического фермента в молозиве коров, содержащихся на летнем рационе, 1124032 была на 65 Ж вьппе, чем в молозиве коров содержащихся в зимнем рационе, т.е. разница в величине активности, полученная в молозиве, отобранном через час после отела, сохранилась 5 в течение первых суток.
За семь дней лактации уровень протеазы в молоке коров обеих. групп возрос более нем в 6 раз и составил
20,2 10 у (Т группа) и 7,37 10 и (П груйпа).
Необходимо отметить, что содержание трипсиноподобного протеолитического фермента в молозиве и молоке коров обеих групп до 40< дня лактации 15 возрастало. относительно равномерно.
Затем за следующие 20 дней содержание фермента в молоке коров в летний период года возросло более чем в
60 раз, а в молоке коров, содержа- 2О щихся на зимнем рационе, более чем в 600 раз.
Кроме того, активность фермента, 25 связанного с казеиновой фракциеи. молока, наивысшая уже через час после отела, причем также как и общая протеолитическая активность .молока в
2 раза вьппе у коров, содержащихся на летнем рационе.
В противоположность общему содержанию фермента в молоке, активность казеин-связанного фермента за . первые 24 ч после отела резко падает и к концу первьж суток составляет 35 около 3% от первоначальной величины в молозиве коров T группы и 97 в молозиве коров П группы.
3a: следующие семь суток казенн-связанная протеолитическая активность достигала 0,17 и 0,07Х соответственно. А к 40 дню лактации активность связанного фермента соизмерима с общей протеолитической активностью молока.
В дальнейшем до 60 дня лактации сохраняется медленное снижение активности фермента, адсорбированного на поверхности казеиновых мицелл на фоне резкого повышения общей протеолитической активности молока.
Таким образом, впервые было проанализировано молозиво и молоко коров черно-пестрой породы, содержащихся на летнем и зимнем общехозяйственных рационах, и исследована динамика содержания трипсиноподобного протеолитического фермента, находящегося как в свободной форме, так и связанной с мицеллами казеина.
Предложенный способ апробирован с положительным результатом на 400 образцах в лабораторных условиях.
Предложенный способ. по сравнению с известным является более эффективным; имеет высокую чувствительность сравнимую с чувствительностью радиоактивньж способов, позволяет определить активность фермента во фракциях молока; сокращает время на его . проведение; несложен по технике выполнения.
; 7
1
1124032
А
U
О ж
О л
I й
l 0
О
Ф
° I
И
I 1 1
О Ж
Еi 1 1 I 0
5 Qg
I» P
О С»
1 I 1 I л
I I I I ео.
П. С»» !» П. О С ССЪ !»» С» С . С» . Ь.
«Ъ «Ъ «Ъ «Ъ « ) СЧ «Ъ С Ъ С Ъ «Ъ «Ъ РЪ
f Ф
О л
:Ч
О О О О О О О О О О . О л л л л л л л л л л л
СЧ СЧ СЧ СЧ СЧ СЧ СЧ СЧ СЧ CV СЧ
О О л л
CV СЧ
1 !
I
I
Ф Ф л л л л
О О О О л л л л л . л л
О О О О О О О О О б л
Щ
О ф
О О О О О О О О О л л л л л л л л л
СЧ CV СЧ СЧ СЧ СЧ СЧ CV СЧ
О О О О л л л
СЧ СЧ CV СЧ
O л
СЧ
О О О О О О О О ф O e О
° \ л л л л л
С0 ф ф ф ф ф ф ф .Ф 0 ф ф
О ф л ф
Ц
О
С4
О CO О сЧ О О О О О О О О О
СЧ! С Ъ СЧ СЧ CV СЧ C4 CV СЧ СЧ
О
О л
О ф
О
О л, O
3g
О
Ж
:Э
О О
И С Ъ
lg
Ф О
О Е О и 0
Ц 1
ФС О
Щ М Ж
М Р
Оъ
О О О л л л
О О О
+f +I 1!
С Ъ О
«Ъ ОЪ !»
«Ъ Л Ф л л л
О О О
СЪ О СЧ а
О О
О О О О л л л
О О О О
+1 +! +1 ф О С Ъ
Ch - ОЪ С сО О л л A л
О О О О
O л
I (» ь л
«Ъ ОЪ
СЧ
О О л л
О, О
+< +C
О ф
СЧ СЪ л л
О О
Ch Ch
Ю
О О л л
О О
+! +1
° ГЪ
С О О л л
О О
i)24032
CV 1 ф о в л л сЧ н +! ь
СЧ С л л
00 СО
М С Ъ
Ц ф
I Æ
Ф
1 Е
1
В-л
I
I o
1
1 э.
М
1 о
«0 о ф .ф
О о о о л л! I ! !
I I I
I
I
1
I
I
I .
1 I
» 1 л л л л л r
С Ъ сЪ СЪ М М М
3 ф э э
I Еч О,
1 — — 1о о л л
СЧ СЧ
1 о о л л
СЧ «Ч о о л л
С1! «Ч о
i» о э
I ..Од
ГГГ !
1.Ф О л л л л о о о о
i3 CV л л о о о . о л л
СЧ N о о л л
СЧ СЧ ь л
«Ч
)1 о о о о о о л л л сч м - I
I л. л
CV
1
I о о о л л л
00 00 CO о о о л л л
Оъ 00 00 о л
СО а (1 э л
Ц ф о
3 Q о о
СЧ СЧ о о
«Ч «Ч о о
СЧ СЧ о сч
СЧ СЧ э I
Ц
О Л а I
1"
1 сО аО о о л ° Ь о о.
+9 +!
С Ъ
СЧ л л о о о
D л
О ф!
С Ъ
« Ъ л
Оъ 00 о о л. л о о
+! +I
° . СЧ л ао
1О О л л о о
Ю
Ю л
Ю
+I м л л
1
1 .I
1 ва
1ч о. ж
63 ж
< о
1 о
3g о о и !
° М ф н ф а
fe
О
Cl ь
v 3 о л о
+ л сО .D л о э
Ж ж ф
g p ! лз
& 1О м о
Р
I- D жо эо л.» М
1 л
00 л л о
+! +« о о
00 1О л аб Л
«"Ъ л л л л
М М « Ъ С Ъ о о о о о о о о л л л л
00 00 00 00
1124032
0Ъ
ОЪ л Ь
О
+! 3е ф. л» N 00 л л
СЧ Л
РЪ
I )
1 1
«rr х х
««3
«0 о и в
I 1
8 о
& I I
Р
3 х
Э б
I ,О
1 1
I I
I . 1
1 1
1 — — 1
1 1
I
1
I
«СЪ
1
1
1
1 ю I
1 л л r . r л л л
Р \ С Ъ С Ъ С ) С Ъ СсЪ С Ъ С Ъ « 1 л О л О
СЧ С Ъ
О О О О О О О О О
О О О О О л л л л % л л л л л л л
% %» %»
О О О О ГЪ О «- л л л л л л
СЧ «Ч СЧ СЧ О
О
СЧ
О О О О О л л
С Ъ СЧ N N N
C) л
СЧ 1
1 .1
3 3 ч0 О
О Ф 0 О Ф О О О О О О О О О л л л л л л л л л л л л л, СО»Ф W СО ф «3Ъ 00 00 Ф 00 00 СО 00 00
Ф О O О О О О О О
СЧ СЧ СЧ N N СЧ N СЧ
О О О О О
СЧ СЧ СЧ СЧ СЧ
СЧ
1 I
1 I
1 1 4
Е
I 1
031 1
Х 1 х
I 1 фб о о I
31
1
I
1
1 1
I 1
I
1, 1
1 б
1 I
1 !
1 I
С! I
3 . 1
1! сЧ I
1 1
I 1
1 1
1
3 Ъ3
1
1
I
1 1
1 1
I - I.
СЧ
СЧ
СЧ
+!
N л
СЧ
«Г\
С )
О О л л
О О
+! +!
С Ъ С Ъ
СЧ а
% . л
° л»
О сЪ ф
4 0!
М х о б:2, й
О л л
N ъ»
+! +!
° оъ
N Ch л л
00 . Ф
С ) С"Ъ О СЧ
СЪ О л л
О О
+! +!
О О л л ч Ф
«3 О л
«Ч
+!. +!
СЪ
Ill СЧ л . л
° — 00
СЧ РЪ
С Ъ »ф
О О л ° л
° N СЧ
+! +! -б.! О С« »
N е» л л л
«Ч ° ф
N C i
1 .
I
I (1
I
1
l
1 °
1
I
I
1
1
I
1!!24032!
СО
СО СЧ ъ СЧ л л
+! +I
М О
О 44Ъ л л ч» 4О
o:ф о л л о о
+! +! м м
С Ъ СЧ л л о о л с! ф л л л
МР - СЧ
4С4
+! +!. +I
С Ъ СЧ О
Л. 0О О
° 1 л л
ОЪ ф
СЧ б
СЧ
СЧ ф л о
+ м
СЧ
О
° \ л
Ю. Cvl ж
04
СЧ ч». 4/Ъ л л
О ч»
+! М.л ф
М СЧ л л
О
М СЧ
СЧ л л о
4-! +!
Ч 4 м м б л, л
СЧ, М
О СЪ LC4 . СО л л о. о
+4 +4 ф Ch
ОЪ О л л сЧ
СЧ . 00
Ch cn л л о
+I +! л О1 О М л л
44Ъ о л
+I
44Ъ
CO л г
° CO л л сО
СЧ
4 %» л л
44Ъ . ОЪ л л м О л л о о
+4. +!
Ch Л о, О СЪ .ЪСЪ
Ь л Ф
+4
CO
4п О
Ж
О ф
М СЧ . л
С Ь л л м о
4 4 CV
О о л л
° — . 0!Ъ
+! +!
СЧ о л л
Ch 00 О СЧ с ъ . м
° \ о. о
+! +! о о л л
С Ъ М
U 11
О 4Ф
2о
4 4»
0 0 о
Р1!
v о л сч
Ы о v, &
Р Р . Ь Р. > Р
0 0 0 v v v v v а
Cn e Л Ch - СЧ СЧ М З СЪ О
i»
О я j
Ц
О
5 ф м
И
s0
Ею и
О ф
4 .О
Е
443 .44 л
V II
О
А !44
Ф о
Э
О
4 и
0 44Ъ О СЧ г СЧ
° \ ф an л м н ф СЧ
Ch М л л ч» О. 4СЪ ф м о л л о о
+4 +4
° 1/Ъ ф л л л о.а
Ch 3 л л сч л
О О
СЧ г+!. О г л ° I о м
В 4Ъ
О1 ф г»
4СЪ СЪ л л о
+! +!
СЧ л л м м
СЧ
Ф
+!
СЧ
СЧ л
С"Ъ
МЪ
0О
СЧ л о
+I
4Г4
С Ъ
СО О л о .+I
О. О л
ОЪ сО ф л ь м
C) ь л
СЧ м л
СЧ
+I 3
Ф л
0О м
4Ъ О л
О
+! з
О О
C4 л л
Ф
+4
ЧЭ л
СЧ
СЧ
О О л о
f4
ССЪ
СЧ л м .4 л
+! л
С Ъ О
4/Ъ
Ch л. о
+!
СЧ
an л ф
СЧ
Ф»
+! л л л
СЧ
СЧ л
+I О
С Ъ м л о
+4 О л. л
СЧ
CV л
+! о
Ch л
4Ъ
СЧ м
О
+! л О л о
C) л
+!
041 О л
СЧ о
СЧ
f4 о
С Ъ ф (Ч О ф о о л о о
+! Ъ"
o cl
СЧ» л л
o o л с"Ъ л о л
СЧ +!
+I 0O
4СЪ
О л л
СЧ м 0О
an o л л о о
+I о л
- о о
С Ъ 0О
Ch л л О
О г+I +!
Ъ О
СЧ ц1 л л
4Г\
ОЪ СЪ
СО о о о о л л о о
fI
CV о о
° л о о
Г4 44Ъ л . л
О Ch О
-+! f I о о О
A A а- О1
В 44Ъ
СЪ О
° 4 л л о. о
+! +! СЧ м л л
o o
СЧ СЧ
Ch Ch л A
СЪ ССЪ
СО
+I +4 сч О о о л л
СЧ О
Ch ф
