Способ стабилизации глюкоамилазы,продуцируемой @ @ в процессе хранения

 

1. СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ ГЛЮКОАМИЛАЗЫ, ПРОДЛЩРУЕМОЙ ASPERGILLUS AWAMORI В ПРОЦЕССЕ ХРАНЕ1ШЯ, предусматривающий вьфащивание культуры на агаризованной питательной среде, содержащей крахмал и необходимые минеральные соли с последующим пересевом конидий на хранение в пробирки на питательную среду аналогичного состава, отличающийс я тем, что, с целью повышения глюкоамилазной активности и стабильности ее в процессе хранения, перед посевом конидий на хранение осуществляют активацию культуры путем повторного выращивания ее на концентрированной агаризованной питатель§ ной среде, содержащей водные вытяжки из солодовых ростков и отрубей в (Л соотношении 1:1. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют Q 5%-ную водяную вытяжку из солодовых с ростков и 10%-иую водную вытяжку из ппшничных отрубей.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

09) (И) Р151) С 12 Й 9/34

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

Ъ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЙ;. ; -"" ". /

K ABTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ / (54)(57) 1. СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ

ГЛИ)КОАМИЛАЗЫ, ПРОДУЦИРУЕМОЙ АБРЕК(21) 3517107/28-13 (22) 04.11.82 (46) 15.10 .84. Бюл. 9 38 (72) Б.А.Устинников, E.À.Äâàäöàòîâà и Г.И.Комарова (71) Всесоюзный научно-исследователь- . ский институт продуктов брожения (53) $57.15(088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

У 658169; кл. С 12 М 1/00, 1979е

2. Бланков Б.И., Клебанов Д.Л.

Применение лиофилиэации в микробиологии. M., Медгиз, 1961, 3. Татаренко Е.С., Манько В.Г.

Изучение условий хранения плесневых грибов коллекции, УкрНИИПП, В кн.

"Краткие тезисы докладов f конференции о задачах и методах работы микробных коллекций СССР". М., АН СССР, 1972, с. 45-46, GILLUS AWAM0RI В ПРОЦЕССЕ ХРАНЕНИЯ, предусматривающий выращивание культуры на агариэованной питательной среде, содержащей крахмал и необходимые минеральные соли с последующим пересевом конидий на хранение в пробирки на питательную среду аналогичного состава, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения глюкоамилазной активности и стабильности ее в процессе хранения, перед посевом конидий на хранение осуществляют активацию культуры путем повторного выращивания ее на концентрированной агаризованной питательной среде, содержащей водные вытяжки из солодовых ростков и отрубей в соотношении 1:1.

2. Способ по п. 1, о т л и ч аю шийся тем, что используют

57.-ную водяную вытяжку из солодовых ростков и 10Х-ную водную вытяжку из пшеничных отрубей.

111»36!

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может использоваться для хранения микроорганизмов в музеях коллекционных культур и лабораториях.

В настоящее время для хранения микроорганизмов — продуцентов используется целый ряд приемов, например периодические пересевы микробных культур на свежие питательные среды, 1р хранение микроорганизмов в сухих стерильных почвах, песке, каолине и солевых растворах (11 .

Однако при этих методах хране15 ния падает ферментативная активность микроорганизмов и необходимо проведение множества пассажей для получения первоначальной активности.

Известны также способы стабилизации активности микроорганизмов в процессе хранения, предусматривающие выращивание их, высушивание путем модификации и расфасовку (2j .

Однако моддификация имеет ряд не- достатков, связанных прежде всего с трудоемкостью процесса и использованием дорогостоящего вакуумного оборудования и приемника для хранения больших коллекций микробных культур

Зр в крупных лабораториях, располагающих специальным оборудованием.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ стабилизации ферментативной ÇS активности Aspergillus awamori в процессе их хранения, предусматривающий выращивание культуры на агаризованной питательной среде, содержащей крахмал и необходимые минераль-4р ные соли с последующим пересевом конидий на хранение в пробирки на питательную среду аналогичного состава (3) .

Однако при этом способе наблюдается потеря активности ферментов в процессе хранения культуры.

Цель изобретения — повышение глюкоамилазной активности и стабильности ее в процессе хранения.

Цель достигается тем, что согласно способу стабилизации глюкоамилазы, продуцируемой Aspergillus

8wamori, в процессе хранения, предусматривающему выращивание культу- 55 ры на агаризованной питательной среде," содержащей крахмал и необходимые минеральные соли с последующим

74 з пересевом конидий в пробирки на питательную среду аналогичного состава, перед пересевом конидий на .хранение осуществляют активацию культуры путем повторного выращивания ее на концентрированной агаризованной питательной среде, содержащей водные вытяжки иэ солодовых ростков и отрубей. в соотношении 1:1. Используют 57-ную водную вытяжку из солодовых ростков и 107.-ную вытяжку из пшеничных отрубей.

Сущность способа заключается в следующем.

Микроорганизмы вида Aspergillus

awamori выращивают вначале на питательной среде, содержащей агар-агар, крахмал, хлористый калий (КС1), сернокислый магний МдЯ04), однозамещенный фосфорнокислый калий (КН2Р04), азотнокислый натрий (NaNO ), сернокислое железо (FeS04) при 22-24 С в течение 12-14 сут.

Затем осуществляют активацию путем переноса конидий в чашки

Петри на концентрированную питательную среду, содержащую водную вытяжку иэ солодовых ростков и отрубей в соотношении 1:1 в присутствии 2Х агара в течение 12-14 сут до достижения зрелости конидий с периодическим отбором колоний по активности.

Для проверки активности культуру

Aspergillus awamori выращивают глубинным методом на питательной среде следующего состава: солодовые ростки, крахмал, ИаИОф, КС1, MgS04 КН РО, ГеБО в течение 2-3 сут при 30-35 С.

Д

После выращивания глубинным методом наиболее активный вариант пересевался для хранения на питательную среду: агар-агар, крахмал, NANO>, Mg SO4, KCl, КНдР04, Fe S04, Пример 1. Выращивают в пробирках штамм А peI (» 11 u agaeor»

466 на агаризованнои питательной среде, содержащей следующие компоненты,вес.Х:

Крахмал 2

RCl 0,05 м яо„ 0,05

КН2Р04 0 1

NaNO1 0»91

Fe S0y 0,001

Агар 2

Выращивание осуществляют в течение 1 сут при 24ОС и рН 4,7. Получают культуру с активностью В(v:».мл.

, /, 11186

25

Таблица,. 1

Способ

Активность ферментов в культуре без активации (контроль) !

Ю с активацией

Альфаамилаза

5,1

5,1

Глюкоамилаза, ед/мл

117

Для активации штамма готовят среду .следующего состава: водная вытяжка из солодовых ростков с массовой концентрацией 5Х вЂ” 50 мл; водная вытяжка из пшеничных отрубей с массовой концентрацией 10X — 50 мл; 2Х агар-агара.

10Х-ная водная вытяжка из пшеничных отрубей готовится следующим образом. Навеска отрубей заливается 10 определенным количеством воды (1O r отрубей на 100 мл воды), помещается на кипящую водную баню и выдерживается в течение 1 ч, после чего фильтруется. 15

Таким же путем готовится водная

5Х-ная вытяжка из солодовых ростков (5 г солодовых ростков на 100 мл дистиллированной воды). Экстракции проводят при 30 в течение 1 ч. По0 лученные вытяжки смешиваются 1:!.

Затем к смеси добавляют агар-агар и стерилизуют 30 мин при 0,5 Ы(а, -рН 4,7.

Приготовленную среду разливают по 15-20 мл в стерильные чашки Пет ри и на поверхность застывшей агаризованной среды пипеткой наносят 1 мл конидиальной взвеси.

Приготовление суспензии конидий проводится следующим способом, Пробирки с 12-суточной культурой, выращенной на агаризованной среде с крахмалом, заливают 10 мл стерильной З5 дистиллированной воды, при помощи петли снимают конидии с поверхности, затем готовят разведение 10 — 10 .

Приготовленную суспензию культуры

40 наносят на поверхность застывшеи агаризованной концентрированной среды таким обоазом чтобы после вы1

g ращивания в термостате при 22 С в течение 12 сут на поверхности выросло не более 3-7 колоний.

После 12 ч роста проверяют активность активированной культуры. Для этого 1/2 часть колонии пересевают на питательную среду следующего сос- 50 тава, вес.Х:

Солодовые ростки

Крахмал

NaNO p

KCl 55

И1; 804

КН !04

Ге804

74 4 и выращивают в течение 3 сут при

35 С. Получают культуру с активностью 117 ед/мл, Затем активные колонии пересевали в пробирки на агаризованную питательную среду того же состава, что и.для выращивания, вес.Х:

Крахмал 2

КС1 0,05

Ng SOq

КН РО! О, 1

N;-,МО 0,91

Ре 804 0,001

Агар 2 и хранили в течение 3 мес, при этом активность сохранялась на уровне

117 ед/мл. В контрольной неактивированной культуре активность глюкоамилазы через 3 мес была 80 ед/мл.

Пример 2. Хранят штамм

Asp. awamori Т-1. Выращивание, активацию и последующий пересев осуществляют на среды, аналогичные в примере 1.

Перед активацией после 12-сутоточного роста культура имела активность 25 ед/мл, после активации—

30 ед/мл и сохраняет свою активность в течение 3 мес. В контрольной культуре активность глюкоамилазы в процессе хранения снизилась до

20 ep/мл.

Результаты свидетельствуют, что при активации культуры на концентрированной агаризованной питательной среде активность увеличивается и сохраняется в течение 3 мес при ее хранении.

В табл. 1 приведена активность ферментов при хранении различными способами.

Продуцент Asp. awamori 466

1118674 олжение табл. I

Соотношение компонентов концен15 рированной среды, вес.X

Продуцент Asp.awamorx Т"

5:10

117

Альфаамилаза

4,5

1,5

4:9

3:6

Глюкоамилаза, ед/мл

25. 30 б:12

8:14

100

100

Во всех .случаях активность глю- коамилазы сохранялась в процессе хранения в течение 3 мес.

Таким образом, реализация изобретения позволяет. повысить активность. глюкаамилазы и стабилизировать эту активность в процессе хранения.

Составитель Е.Воробьева

Редактор Т.Веселова Техред Л.Микеш Корректор A- Ильин

Заказ 7374/19 Тираж 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r Ужгород, ул. Проектная, 4

Пример 3. Выращивание, ак- . тивацию и пересев проводят аналогично примеру 1, но для активации ..в составе среды используют водйые вытяжки из солодовых ростков и из пшеничных отрубей различных концентраций..

Результаты представлены в табл.2.

Таблица 2.

Активность ГлА в процессе хранения, ед/мп