Поли- @ -оксисукцинимидные эфиры аминокислот в качестве реагентов для пептидного синтеза

 

Поли-М-оксисукцннимйдные эфиры аминокислот формулы О -71 N-OdOK косо Ь СНз Н(-1Г Hid dHt о ti I К 0.0 где R - остаток N-защищенной -аминокислоты; R- остаток сшивающего агента: бензидина, диаминодифенилоксида , диаминодифенилметана, в качестве реагентов для пептидного синтеза. 00 Од 00 О

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН аЕ, (111

Вш С 07 С 103/52

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ".

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ аминокислот формулы

0 0

ОЗ ЗОбОО 2

СН2

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

llO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTHA (21) 3525545/23-04 (22) 20.12.82 (46) 15. 10.84. Бюл. ¹ 38 (72) Н.А.Самойлова, Ю.А.Давидович и С.В.Рогожин (71) Ордена Ленина институт элементоорганических соединений им.А.Н.Несмеянова (53) 547.964.4.07(088,8) (56) 1. Шредер Э., Любке К. Пептиды.

Т. 1. M., "Мир", 1967, с. 143. - .

2. Хиршман Р., Вебер Д. Тактика

;минимальной защиты в пептидном синтезе.-В кн. "Химия полипептидов".

Под ред. Катсоянис; М., "Мир", 1977, с. 144-165.

3. Гершкович A.À., Серебряный С.Б.

Применение водорастворимых 2-нитро-4-сульфофениловых эфиров в синтезе пептидов-."Биоорганическая химия", 1978, т. 4, № 8, с. 1129-1131.

4. Авторское свидетельство СССР № 342865, кл. С 08 F 222/06, 1972. (54) ПОЛИ-N-ОКСИСУКЦИНИМИДНЫЕ ЭФИРЫ

АМИНОКИСЛОТ В КАЧЕСТВЕ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ

ПЕПТИДНОГО СИНТЕЗА. (57) Поли-N-оксисукцинимидные эфиры . где R — остаток N-защищенной .аминокислоты;

R — - остаток сшивающего агента:

1 бензидина, диаминодифенилок- O сида, диаминодифенилметана, .в качестве реагентов для пентидного синтеза.

1118636

Ф

Изобретение относится к новым соединениям — поли-N-оксисукцинимидным эфирам аминокислот формулы

0 0

-00 o% зОбО0 0

0 где R — остаток И-защищенной аминокислоты;

R -- остаток сшивающего агента:

1 бензидина, диаминодифенилоксида, диаминодифенилметана, в качестве реагентов для пептидного синтеза, которые могут найти применение.в синтезе биологически активных

25 соединений — пептидов методом активированных эфиров.

Использование активированных эфщ>as й-защищенных аминокислот $1 ) широко известно в пептидной химии.

Наиболее перспективным и экономич30 ным является осуществление синтеза пептидов методом активированных эфиров в водных средах, поскольку это позволяет осуществлять синтез в соот" ветствии с принципом минимальной за- 35 щиты функциональных групп и, в оптимальном варианте, исполЬзовать амино-. компонент в свободном виде Е23, Известно использование 2-нитро-4-сульфофениловых эфиров N-защищенных 40 аминокислот в .синтезе пептидов методом активированных эфиров, процесс проводят в водной среде ГЗ 3.

Однако использование 2-нитро-4-сульфофениловых эфиров N-защищенных 45 аминокислот осложняет очистку сиитезируемого пептида за счет наличия в системе низкомолекулярного активированного эфира и соответствующего фенола. 50

Цель изобретения — новый реагент для синтеза пептидов, позволяющий получать целевые продукты с высоким выходом и высокой степенью чистоты. . Поставленная цель достигается 55 поли»й-оксисукцинимидными эфирами аминокислот формулы f в качестве реагентов для пептидного синтеза.

Предлагаемые поли-N-оксисукцинимидные активированные эфиры получают методом смешанных ангидридов из

К-защищенной аминокислоты и N-оксисукцинимидного полимера-активатора.

Полученный полимерный активированный эфир легко отделяется от.растворимых продуктов реакции. Полимерные активированные эфиры-стабильные соединения, могут храниться в отсутствие влаги длительное время (более года).

Полимер-активатор получают смешиванием ароматическими диаминами с жесткой вытянутой структурой молекулы— бензидином, диаминодифенилоксидом илн диаминодифенилметаном (с получением сферических гранул), смеси двух сополимеров. Это сополимер малеинового ангидрида c N-винилпирролидоном и сополимер малеинового ангидрида с этиленом; далее производят обработку сшитого полимера гидроксиламином в условиях 1.4 1.

Пример 1. Получение N-оксисукцинимида.

К раствору сополимера малеинового ангидрида с И-винилпирролидоном—

100 г (480 ммоль) и малеинового ангидрида с этиленом — 60 r (480ммоль) и 300 мл диметилформамида (ДМФ) прибавляют раствор 19,0 r (96 ммоль, 10 мол.%) диаминодифенилоксида в 80мл

ДМФ; полученную гомогенную систему охлаждают до -9 С, затем выливают при о перемешивании в 3000 мл силикона (ПЭС=5). Образовавшуюся эмульсию перемешивают при комнатной температуре

3 ч и оставляют на 24 ч. Затем полимер отфильтровывают., промывают эфиром, ДМФ, смесью уксусного ангидрида с ДМФ (2;1) по объему, ацетоном, эфиром высушивают. Получают 170 г сферически гранулированного полимера.

ИК-спектр (1, см "): 1860, 1790. Содержание остатков малеинового ангидрида — 4,53 ммоль/г. Теоретическое содержание 4,65 ммоль/г.

Суспензию полученного сшитого по.лимера в 1500 мл раствора 150 r (2158 ммоль) хлоргидрата гидроксиламина в пиродине нагревают 5 ч при

60 С. Полимер отфильтровывают, промывают водой, 0,5 н. НС1, водой, ацетоном, эфиром, высушивают в вакууме.

Выход 195 г. ИК-спектр .(, см ):

1650, 1710, 1780, 3200-3500.

Найдено: Я 11,21%. Вычислено:

N 11,50%.

6 4 вают водой, фильтрат подкисляют лимонной кислотой ао рН 2 и экстрагируют этилацетатом. Этилацетатный слой сушат сульфатом натрия и упаривают в вакууме. Остаток кристаллизуют из системы эфир — гексан. Выход

0,855 r (90,6 ), Т.пл. 187-188 С.

Найдено, .: С 57,85; Н 7,73;

N 8,50.

С, Н „Н О

Вычислено, %: С 57,72; Н 7,68; .

N 8,97.

В синтезе использованы полнмер. активатор, сшитый 10 мол. бензидина.

Пример 4. Трет-бутилоксикарбонил-пролил-аргинин.

К раствору 2,26. г (13,0 ммоль) аргинина в 40 мл воды прибавляют

12,1 г (13,8 ммоль) поли-Н-оксисукцинимидного эфира трет-бутилоксикарбонил-пролина и перемешивают реакционную смесь 48 ч при рН 9,0, поддерживая рН добавлением N-метилморфолина; в процессе реакции добавляют еще

50 мл воды. По окончании реакции полимер отфильтровывают, промывают водой, метанолом. Фильтрат упаривают в вакууме, остаток промывают этилацетатом, эфиром. Кристаллизуют из системы метанол-эфир. Выход 4,10 r (82,0 ) . Т.пл. 178-183оС ГЫ32>о

= — 48,4 (с 1, метанол) .

Найдено,. : С 49,44; Н 7,97;

N 18,00.

Вычислейо, : С 49,36; Н 7,97;

N 17,99.

В синтезе использован полимер-активатор, сшитый 10 мол.й диаминодифенилоксида.

Пример 5. Амид трет-бутиолоксикарбонил-грицил-триптофил-метионил-аспартил-фенилаланина.

К 0,80 r (О 1,14 ммоль) амида трет-бутилоксикарбонил-триптофилметионил-аспартил-фенилалонина- при" бавляют 13,0 мл трифторуксусной кислоты, выдерживают раствор 1 ч .в токе аргона, продукт осаждают эфиром, фильтруют и промывают эфиром.

После высушивания полученный трифторацетат растворяют в 30 мл воды, добавляют 2,4 г трнэтиламина и 6,0 г (8,4 ммоль) поли-N-оксисукцинимидного эфира трет-бутилоксикарбонил-глицина. Реакционную смесь перемешивают 45 ч при рН 8,0 (поддерживают добавлением триэтиламина) и комнатной температуре. Через 20 ч после

3 111863

Содержание реакционноспособных

N-оксигрупп в полимере-активаторе

4,22 ммоль/г. Теоретическое содержание 4,35 ммоль/г.

В описанных условиях получают сферически гранулированные поли—

N-сукцинимиды с другими ароматическими диаминами: бензидином, диаминодифенилметаном (сшитые 10 мол. ) .

Пример 2. Поли-Н-оксисукциминидный эфир трет-бутилоксикарбонилпролина. Раствор 1,03 г (9,0 ммоль)

Вос-пролина и 1,03 г (9,0 ммоль)

N-этилморфолина в 16 мл ДМФ охлаждают до -10 С, при перемешивании прибавляют 1,22 г (9,0 ммоль) изобутилхлорформиата. Реакционную смесь перемешивают при -10ОС 5 мин, затем прибавляют 2,00 г (8,44 ммоль) N-оксигрупп поли-N-оксисукцинимида; температуру реакционной смеси постепенно доводят до 40 С и перемешивают 1 ч при этой температуре. После охлажде-, ния реакционной смеси до комнатной температуры полимер отфильтровывают, промывают метаном, ацетоном, эфиром ,и сушат в вакууме. Получают 2,35 г полимерного эфира. Содержание аминокислоты (определено по привесу на исходный полимер) 1,52 ммоль/г поли-,.

30 . мера. ИК-спектр (, см "): 1740, 1820.

В аналогичных условиях получают . поли-N-оксисукциннмидные эфиры Boc-Clu содержание аминокислоты в полймере 1,40 ммоль/г, ИК-спектр (4, см "): 1740, 1820; Tos-Ala, содержание остатков аминокиелоты в полимере 1,63 ммоль/г, ИК- спектр (4, см " ): 1740, 1820; Вос-Glu(OBZ1) содержание остатка аминокислоты в полимере 1,55 ммоль/г, ИК-спектр (4, см-" ): 1740, 1820.

Синтез пептидов с помощью предлагаемых полимерных активированных эфи45 ров.

Пример 3. Трет-бутилоксикарбонил-пролил-пролин.

К раствору 0,69 г (6,0 ммоль) нролина в 20 мл 0,1 М боратного буфера рН 10,0 прибавляют при переме50 шивании 2 r (3,02 ммоль) поли-N-оксисукцннимидно го эфира тре т-бутилок сикарбонил-пролина и перемешивают реакционную смесь 1 ч, затем в загустевшую реакционную смесь добавляют еще 5 мл того же буфера, через 2 ч перемешивания при комнатной температуре полимер отфильтровывают, промы1118636

Выход, Ж, по способу

Пептид

Предлагае- Известному мому

I-Glu-Phe-0H

Т.пл. 125 С (dц 13 - +38,5 (с 1, этанол) 75

Т.пл. 132 С (Ш) лита Т ° ïë, Вос-Glu-Phe-ОН 84

Т, пл. 187-188 С

Т.пл. 186188 С

ГАЗ р = -31 5 (с 1,этанол)

Т.IIJI, 1 15 С, j@l р = -2,2 (с 1,диметилформамид) Tos-Ala-1.еи-0Н 89 (,",= -31 (с 1,этанол)

Т.пл. 115 С, (о ) > =-2,2 (с 1,диметилформамид

Вос-СТи(ОВв1) -Glu-ОН

91 щцщПИ Заказ 7366/17 Ти) аж 409 Попписное

Филиал ППП "Патент, г.Ужгород, ул,Проектная, 4

S начала реакции добавляют,еще 1 r .. полимерного эфира и 20 мл воды, По окончании реакции полимер отфильтровывают, промывают водой; фильтрат подкисляюъ концентрированной НС1 до рН 3 и добавляют NaC1 до насыщения.

Выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой, эфиром, высушивают.

Выход 0;792 г (91,2X), Т.пл. 192-195 С (с. разл.). (ф3р= 24,2 (с 2, ДМФА) .

Найдено, Х: С 56,38; Н 6,22, N 12,84; S 4,19.

Свен41Н709$ Вычислено, Х: С 58,36; Н 6,29;

N 13,00; S 4,25.

В синтезе использован полимерактиватор, сшитый 10 мол.7 диаминодифенилметана.

Полимерные активированные эфиры могут быть использованы многократно.

Методика регенерации полимера.

5 r полимера, выделенного после проведения аминолиза по примеру 3, помещают в раствор 5 г гидроксила-. мина в 50 мл воды и перемешивают реакционную смесь 2 ч при 60 С. . Затем полимер отфильтровывают, промывают водой, 0,5 í.НС1; водой,.ацетоном, эфиром, высушивают в вакууме.

Выход полимера 4,95 r Содержание

N-оксигрупп 4,20 ммоль на 1 г полимера. ИК-спектр (v, см "): 1650, 1710, 1780, 3200-3500. Отсутствуют

5 полосы в ИК-спектре (4, см " ): 1740„

1820, соответствующие активированному эфиру °

Выход и физико-химические констан ты пептидов, полученных с использованием 2-нитро-4-сульфофениловых эфиров N-защищенных аминокислот (известный способ) и при использовании поли-N-оксисукцинимидных эфиров аминокислот (предлагаемый способ) приведены в таблице.

Как видно из таблицы, использование поли-N-оксисукцинимидных эфиров аминокислот позволяет получать пептиды высокой степени чистоты с высоким выходом (до 902), более высоким (на 203), чем позволяет получать известный метод P3 j.

Предлагаемые поли-Н-оксисукцинимидные эфиры аминокислот дают возможность упростить процесс получения пептидов за счет использования высокореакционноспособных полимерных активировайных эфиров, которые могут быть использованы многократно, а 30 также за Счет простой процедуры выделения целевого продукта.

Физико-химические константы пептидов, полученных по способу

Предлагаемому Известному