Способ определения концентрации днк

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ДНК путем гвдролиза, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени анализа, гидролиз ДНК осуществляют хлорной кислотой, затем нейтрализуют гидролизат и инкубируют в среде с Lactobacillus acidophilus R-26,

СОК)Э СОЮЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) 01) 3щ) С 12 1 68

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ HOMHTET CCQP

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3577285/28-13 (22) 11.04.83 (46) 07.09.84. Бюл. 11 33 (72) К.О.Блох и И.Ф.Паскевич (71) Харьковский научно-исследовательский институт медицинской радиологии (53) 547-.963.32.02(088.8) (56) 1. Спирин А.С. Спектрофотометрическое определение суммарного коли» чества нуклеиновых кислот. - "Биохимия", 1958, т. 23, вып. 5, с. 656-662.

2. Hoff-Jorgensen Е. А Microbiological Assay of Deoxyribonucleosides

and Deoxyribonucleic Acid. — "The

Brochem. J.", 1952, vol. 50, УЗ, р. 400-403 (прототип). (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ДНК путем гидролиза, о т л и— чающий с я тем, что, с целью сокращения времени анализа, гидролиз

ДНК осуществляют хлорной кислотой, затем нейтрализуют гидролизат и инкубируют в среде с Lactobacillus

acidoyhilus R-26.

Цзабрете1311е нуклеиновых кислот и:.;а ..-..:,::.:г:: и О л ь 3 О В я 11 о и р и а 13р е д с - .. : 1 i! ции ДНК В БОдньв; я =,,o" ., г1а гических тканях, Известдн способ ап :.:а":;...:: ."ь центрацик ДНК вЂ”.;ас —::-. лиза а

Сущность метода состав- в к - ..; 3 — . ном гидролизе ДНК =- 0,.5 . :, 110,.31,.; течение 25 мкн г-,-и 100 "", с. -. "г щим определе нкем концентрация,i,, ": 1а формуле, после апределе ..Ия зпа-1апг,и оптической плотно" òè рас аора .",,К при 270 и 290 ю1к -"13,, Однако с помощью даннага метода нельзя определить концентряцк:о, :I!К меньше чем 5 мкг/мл и,,;po: тo: а. метод недостаточна сп цкфнчеь:, гак как определению конце;-.трагь1И -)-ПК;.,ешают примеси РНК.. белка,. полисах;:-.3кдов, Наиболее близким к и13абрете1п:!o по технической сущности к достигаемому результату является микрабиала=êHческий способ определения концентрации ДНК.

СпОсОб ocIIQBH 11 ня Hpc!BBaрpк-тельном фермента;-квнам гкдрали.,гс помощью ДНК-аз в течепп: I б ч и

37 а С с последующей инкуб-:;..-;-!Ã ролизата ДНК в питательной:"г,=;, -, с

Lac tobac illus ас idophi3 с =- Г

37 С. Концентрацию ДН1 . О1 ... ::„ „-:.г,:; калибровочному графику эя,31 :- .:;.:.;:.С»и .оптической плотности ку.,ьтурь:::..":....., -: бов при 650 ммк ат канде,".-: r!, -,Н1. оксиркбон Ksi о «и- QB B: pa " е, - .,- г; дез окскркбонуклеа зкдаг.;.О от:!e327 г ДНК. Зткм - пасаба-. делить концентрацк1о ЦПК и..

0,3 мкг,/мл (2 .

Недостатками известков.:.1 являются ега трудоемкость к q;. . ность (время анализа зяпк нее /10 ч) . Кроме гога., о3ер н-.: н — .„ ный гидролиз -e позволяе: пал извлечь ДНК кз тканей к требу;..г чия дефицитных ферментaтквных и: †;1 :n :. i ратов (ДНК-азы).

Цель изобретения — сокпяше:-г!a в..з,- . . меин анализа.

ПОСТЯВЛЕННЯя ЦЕЛЬ да. г КГ «С, тем, что согласно способу oi p,":i" .а::::.и:: концентрации ДНК путем =-HäðîëHsa гидролиз ДНК осуг1ествляют хлорной

КИСЛОТОЙ р 3 ЯТРМ Н. 1ГГРЯ IКЗУЗЗТ Г:.,!!.:O! 1 зат и кнкубкру1от в cpc;: с яс :а1.:яо. l1lus acidophilus I-26, ! "0=; вазам, Hc oáHoöHMûB реактивы: высакамоле;,".улярняя ДНК, выделенная из зобной железы теленка и диализовянная в течение, сут против H.О, 1 н. НС101, О,, 2 н, Ii <ОН, О, 5 H. HC101, раствор сьш1егп:аго КОН, культура I actobacil1:B ac.I!Ophi пз Н-2з, питательная

cpеда дгя микроорга измов.

5 м:: раствора ДНК смешивают с 5 мл раствора 1 II, НС10 и кипятят на водяной бане в течение 25 мкн. Г1олученгкдралкзят ДНК охлаждают и нейт>Н рал-::3ólë несколькими каплями раствора КОП,. Выпавший оса! Iàê отделяют

"e!3òpèä:óãкраванкем (3000 аб/мин, 20 мкн), Р, надосадочной жкдкости оста1отся продукты кислатнагс гкдролиза

ДП,, in 1це13тряцкю ДПК B надосадачной ..:: :HHêостк определяют спектрофотометричес:::-: .,". o; —,ксываемам эксперименте ка цеH!:paöHB ДНК в растворе саставляо! ч 5 мк; /. 1л (стандартный раствор) ., ",—:;--пд=p i ый растl3op разводят дистил: —,к:..авя 1най "3oäoé для палучеггия раства,:ав,1-1;- —.,; г,каг1азапе концентрации

О,, 25 —: О,к1-/-, -,1, IIB ка1гцого раство- ° ра ДПК »рабкрку атбкра1ст IIo 0,3 мл .

О, 3 ып гпггательной сре,г,:,,,я»1,:"е, :шее микробиологическое

E. „ ,;;;,,—,сл 1 ке ка 1центрацик ДПК осущест -и; нт: —; к -:B c-- о !y nïîcooó

11г:абь! ., IcBHHHI!B мкк13аа13ганкзма пк.Г:.;1руют 13 тгтзмостате прк -.анке 1(3 ч. Оптк-"ескую п»1ат нас l :, культур микроорганизмов

: П13елел.: î —. На спектпа..ьатаметре при „-5l!:»:;:=.. !111я каждого разведения ДНК с. явят и.:3е параллельные пробы. Б

:-Ia -I8ств» .1аобы, пра THB которой про ка яадяят измерение., С.1лккт раствор, с,.«,е..;; H. 0,.3 мл Н О:1 0,3 мл пита

ТЕЛ 1-.110é Г.ОРДЫ а

Н;-1 ас Io!!a;IHH полученных данных . — ра"".:-. 1. Iëèбравочную кривун зависи1остк в:. : H. HHBI Оптической плОтнОсти ... .:ьтур;- микробов ат концентрации

ДНК в растворе.

lq ,я;;"::ага штяммя мккроарганиз.:г в „-:. е в г1»1.ятельной среде про—:.. 1I;г»В .,:,ра»111ЗЯ ДНК яВЛяЕтСя НЕабсо!»:.HûI; к специфическим фактором рост;, . O.-HIå::1трацип ДНК определяется по к,=лкбра13а -:пoN графику, пастроеннодля з =: —.исимастк оптической плотности кул-.=туры микроорганизмов при

65С ммк от:oнцентрации продуктов гид лизa !,1-1:-, в пробе. па сб осу1дествляют сл ду1ощкм об1112062 туры микробов от концентрации ДНК в растворах.

Содержание ДНК в гробе, мкг/мл

Оптическая плотность при

650 ммк

Проба

0,25

0,03

0,50

1,00

1,70

2,55

3,40

5,10

6,80

10, 00 водят в 10 раз. Установлено, что оптическая плотность культуры микробов

30 равна 0,65, 0,66, 0,64 (3 параллельные пробы) и в среднем составляет

0,65 оптических единиц. По калибровочной кривой 0,65 оптических единиц соответствуют 6,75 мкг ДНК в 1 мл.

Общий объем гидролизата равен 2,5 мл.

Следовательно, в 1 лейкоците содержится следующее количество ДНК: (6, 75 мкг ДНК/мл ° 2, 5 мл 10):

29,5 10 = 5,72 10 мкг ДНК или

5,72 10 " г ДНК, что соответствует данным литературы

jo содержании ДНК в клетках млекопитающих.

Нижняя граница чувствительности предлагаемого способа определения

ДНК составляет 0,25 мкг/мл.

Таким образом, предлагаемый способ определения концентрации ДНК позьоляет сократить время анализа в

2,5 раза и не требует дефицитных реактивов.

ВНИИПИ Заказ 6420/ 19 Тираж 521 Подписное

Филиал ППП Патаит",,r. Умлород,ул.Проектная, 4

В таблице приведена зависимость величины оптической плотности кульПример . Определение концентрации ДНК в лейкоцитах крови.

Лейкоциты из гепаринизированной крови выделяют общеизвестным методом с использованием желатины. Клетки промывают холодным физраствором и подсчитывают их количество в камере

Горяева. Затем клетки гомогенизируют и дважды промывают в холодной 0,2 н. НС10 для полного удаления кислоторастворимых метаболитов ДНК (дезоксирибонуклеозиды и дезоксирибонуклеотиды). Полученный после отмывок осадок гидролизуют в 2,5 мл

0,5 н. НС10 в течение 25 мин при

100 б С.) Гидролизат нейтрализуют двумя-тремя каплями раствора КОН и проводят микробиологическое определение

ДНК. После определения оптической плотности культуры микроорганизмов определяют концентрацию ДНК в пробе по калибровочной кривой.

При подсчете лейкоцитов установлено, что их количество составляет

29 5 10 клеток. Для микробиологического определения ДНК гидролизат разО, 045

О, 085

О, 190

0,230

0,340

0,530

О, 650

0,950

0,025

0,050

0, 100

0,210

0,290

0,310

0,540

0,650

1,100