Способ определения степени деструкции клеток

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ДЕСТРУКЦИИ КЛЕТОК, включакяций получение исследуемого материала и воздействие на клеточною суспензии экстремального фактора с последующей регистрацией Физико-химических идме- . нений в реакционной смеси, отличающийся тем, что, с целью повьоиения точности и ускорения спо соба, к клеточньм суспензиям добавляют М раствор 2,2,6,6-тетраметнл-4-оксопипериДин-1-оксйла и 0,5-2,0 М раствор хлористого никеля и по велич :не сигнала электропарамагнитного резонанса определяют степень деструкции клеток.

(}9) (}}) СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

3(5}) (01 N 33 48

ОПИСАНИЕ ИЗОЬРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕПЬСТИУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3353854/28-13 (22) 10.11.81 (46) 23.10.83 Вюл. 9 39

172) Л.В.Иванов, В.а.Моисеев, .

И.И. Гаврилова, Л.В. Цммбал и В.Ю.Василовский (71) Институт проблем криобиологии и криомедицины АН Украинской ССР (53) 612.014(088.8). (56) 1. Патент Франции II 2446479, кл. G 01 N 31/32, 1980.

2. Патент Японии }1 52-37395> кл. G 01 N 33./32, 1977 (прототип). (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ

ДЕСТРУКЦИИ КЛЕТОК, включающий полу" ченне исследуемого материала и воз действие на клеточные суспенэии экстремального фактора с последуюцей регистрацией физико-химических изме- . нений в реакционной. смеси, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью повышения точности и ускорения способа, к клеточным суспензиям добавляют 10 -2 ° 10 М раствор 2,2,6,6-тетраметил-4-оксопиперидин-1-оксила и

0,5-2,0 М раствор хлористого никеля и по величине сигнала электропарамаг« нитного резонанса определяют степень деструкции клеток.

Изобретение относится к криобиологии, в частности к способам определения степени деструкции клеток ткани.

Известен способ определения деструкции клеток злокачественных опу"-, холей в организме человека, который состоит в определении количества клеток в моче человека, разрушенных этерификацией высшими жирными кислотами при рН 4,2 - 5„8 и 80 — 85 C (lj.

Однако способ применим только к злокачественным клеткам и не позволяет непосредственно наблюдать повреждения клеток в процессе экстремальных воздействий.

Известен также способ определения 15 степени деструкции клеток ткани и клеточных суспензий, включающий получение исследуемого материала и воздействие на клеточные суспензии экстремального фактора с последующей >О регистрацией физико-химических изменений в реакционной смеси (2).

Однако способ применим только для .эритроцитов, исключает возможность непосредственного наблюдения повреждения, а также определяет только грубые нарушения мембраны клеток (диаметр молекулы гемоглобина боль-. ше 80 $), является длительным (40

60 мин).

Целью изобретения является повышение точности и ускорения способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения степени деструкции клеток, включающему получение исследуемого материала и

1воздействие на клеточные суспенэии экстремального фактора, к клеточным суспенэиям добавляют 10 - 2-10 М раствора 2,2,6,6-тетраметил-4-оксопиперидин-1-оксила и О,S — 2,0 М,4О раствор хлористого никеля и по величине сигнала злектропарамагнитного резонанса определяют степень деструк ции клеток.

Способ осуществляют следующим образом.

В исследуемую взвесь клеток вводят водный раствор, который содержит стабильный иминоксильный радикал с концентрацией 10 -2 10 М, проникающий в цитозоль клеток и дающий сигнал электропарамагнитного резонанса (ЭПР), регистрируемый на радиоспект" рометре. Затем добавляют парамагнитную соль концентрации 0,5 - 2 М {в норме не проникающую через мембра" ну), что приводит вследствие обменных взаимодействий к уширению (исчезновению) сигнала ЭПР от радикала; находящегося во внеклеточной жидкос- 60 ти, в результате чего наблюдаетсн сигнал исключительно от радикалов в цитозоле, нарушение целостности мемб" раны клеток приводит к проникновению парамагнитных ионов в цитозоль и к полному или частичному ис- езновению сигнала ЭПР. При этом уменьшение сигнала ЭПР пропорционально количеству разрушенных клеток ткани или клеточной суспензии.

В стеклянную ампулу вводят 0,1

l,0 мл водного раствора иминоксильного радикала концентрации 10 - 2»

10 М, 0,1 — 1,0 мл парамагнитной со2 ли концентрацией 0,5 — 2,0 M и 0,88,0 мл взвеси клеток, в результате чего наблюдают сигнал ЭПР от .радикалов, проникших в нитозоль клеток.

Затем исследуемую взвесь подвергают температурному, химическому, радиоактивному или другим воздействиям.

Если в результате происходит повреждение мембраны клеток, регистрируемый спектр имеет меньшую или нулевую интенсивность, в зависимости от числа поврежденных клеток. Отношение

)>î2 к )>osageò процент неповрежденных клеток. .Пример 1. В стеклянную ампулу вводят 0,1 мл водного раствора иминоксильного радикала 2,2,б,б-тетраметил-4-оксопиперидин-1-оксил с концентрацией 10 М> 0,1 мл водного раствора парамагнитной соли NiClg и 0,8 мл взвеси эритроцитов. Охлаждение взвеси клеток до температуры—

3 С с кристаллизацией суспензии и последующий отогрев ее приводит к уменьшению исходного сигнала ЭПР за счет разрушения части клеток. Относительная величина неповрежденных в . результате кристаллизации и отогрева клеток составлнет 563.

Пример 2, В стеклянную ампу" лу вводят 0,1 мл водного раствора радикала 2,2,6,6-тетраметил-4-оксо- пиперидин-1-оксил с концентрацией

1ФМ и кусочек ткани кожи человека весом 100 мг. Затем осуществляют инкубацию при комнатной температуре в течение 30 мин. После этоГо добавляют 0,1 мл раствора соли Н1С1>концентрацией 0,05 М и наблюдают сигнал от радикала в цитозоле клеток ткани кожи..Медленное .замораживание образца со скоростью З.град/мин; до.-.

196 С и медленное оттаивание до комнатной температуры приводит к падению интенсивности исходного сигнала на 15Ъ, что свидетельствует о разрушении 15Ъ клеток.

Пример 3. В стеклянную ам.» дулу вводят 0,1 мл водного раствора иминоксильного радикала с концентрацией 10 М; 0,1 мп водного раствора парамагнитной соли NiC1Z с концентрацией 0,5 M и 0,8 мл взвеси эритроцитов. Наблкщают спектр ЭПР от радикалов в цитозоле эритроцитов. Далее медленно нагревают взвесь со скоростью 2 — 3 град/мин. Выше температуры

+56, >С происходит резкое исчезновение

1049808

Составитель Е.Еитникова

Техред А.Бабинец Коррес<тор А.Зимокосов з.

Редактор Н. Бобкова и ююю«ю е юююееюю ю

««Ю

Заказ 8407/41, Тираж 873 ., Подпионое

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент", r.Óæãîðîä, ул.Проектная, 4 сигнала ЭПР вследствие разрушения клеток эритроцитов.

Пример 4. В стеклянную ампулу вводят 0,1 мл водного раствора иминоксильного радикала с концентрацией 10 МИ 0,1 мл раствора соли МХС1 (0,5 М) и 0,8 мл взвеси эритроцитов.

Наблюдают сцектр ЭПР от радикалов в цитоплазме эритроцитов . Затем добавляют 0,1 мл раствора прижина так, что конечная концентрация его около ЗВ. Взвесь инкубируют при 38 С . в течение 40 мин. Берут дроби через каждые 10 мин. Сигнал ЭПР с течением времени постепенно падает и через

40 мин его интенсивность составляет

40% от исходной, т.е. остается 40В целых клеток. Таким образом, наблюдают кинетику разрушения эритроцитов с помошью протеолитического фер мента Прижива, который расцепляет пентидные связи аоверхностных мемб-. ранных белков эритроцитов.

Пример 5. В стеклянную ампулу вводят 0,1 мл раствора цминоксильного радикала концентрацией 10 М

0,1 мл раствора соли NiCly(0,5 М) и 0,8 мл взвеси зритроцитов. Наблюдают спектр ЭПР от зондов в цитоплаз" ме. Затем добавляют раствор химического детергента тритона Х100 в концентрации 0,1%. Время инкубации при комнатной температуре 5 мин. Регистрация спектров после этого показыва ет полное исчезновение сигнала ЭПР вследствие проникновения ионов N3. в клетки из-за разрушения клеток.

15 Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным позволя" ет добиться высокой точности определения за счет оценки количества неповрежденных клеток во время воздей" ствия .экстремальноГо фактора, а так .же сократить время определения до 3 - 5 мин.