Способ диагностики вирусной инфекции

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

3ур А 61 К 39/00

ОПИСАНИЕ. ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И. ОТКРЫТИЙ

Н. АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ. (21) 3384623/,28- 13 (22) 22.01. 82 (46) 30.11.84. Бюл. У 44 (71) Институт полиомиелита и вирусных энцеФалитов АИН СССР (72) А.С.Караванов.и В.А.Заклинская (53) 576.8.097(088.8) (56) 1 Руководство по лабораторной . диагностике вирусных и риккетсиозных болезней. И., 1965, с. 72-77, Лабораторная диагностйка вирусных и риккетсиозных заболеваний. M., 1974, с. 28-31 (прототип) SU.„A (54)(57) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНОЙ

ИНФЕКЦИИ путем добавления образцакрови больного, содержащего вирус, к культуре ткани с последующим определением. цитотоксического действия вируса,, I отличающийся тем, что, с целью повыпения точности. диагносФ тики, образец крови больного перед добавлением к культуре ткани наносят -. на фиколл-верографин при градиенте плотности 1,075-1,080 гйсм, далее центрифугируют при 800-1000 g 20 —, 30 мин, выделяют лейкоциты и подвергают их бласттрансформации в присутствии фитогемагглютинина.

10454

Изобретение относится к области медицинской вирусологии, а именно к способам лабораторной диагностики вирусных инфекций.

Известен способ диагностики вирусной инфекции путем добавления образца крови больного, содержащего вчрус, в культуру ткани с последующим определением цитотоксического действия вируса 1 . l0

Однакб известный способ недостаточно точен, поскольку при незначительных концентрациях вируса в исследуемом материале обнаружение вируса, а соответственно и диагнос- 1 тика вирусной инфекции затруднительны.

Целью изобретения является повышение точности диагностики..

Эта цель достигается тем, что по 20 способу диагностики вирусной инфекции путем добавления образца крови больного, содержащего вирус, к культуре ткани с последующим определением цитотоксического действия вируса, 25 образец крови больного перед добавлением к культуре ткани наносят на фиколл-верографин при градиенте плотности 1,075-1,080 г/см, далее центрифугируют при 800- 1000 р- 20-30 мин, выделяют лейкоциты и подвергают их бласттрансформации в присутствии фитогемагглютинина (ФГА).

Способ осуществляется следующим образом.

Кровь из вены в количестве 5-10 мл вносят в пробирку с 1-2 мл раствора гепарина (10 ед = 0,0077 мг/мл), перемешквают для предотвращения образования сгустка, наносят на градиент 4О фиколл-верографин в соотношении 1 мл крови: 3 мл градиента, центрифугируют при 800-1000 ф 20-30 мин., При этом эритроциты осаждаются на дно центрифужного стакана, в верхней 4> трети градиента образуется плотная опалесцирующая полоса клеток белой крови, состоящая из 75-80% лейкоцитов и макрофагов. Зону градиента, . содержащую лейкоциты, осторожно от- 50 бирают пипеткой, разводят в соотношении 1:3 средой 199 на растворе Эрла, центрифугируют при,1000-1206Г о- 58 мин, надосадок сливают, осадок суспендируют в 5,0 мл среды 199 на раст-55 воре Эрла и снова центрифугируют при том же режиме. Отмытые таким образом клетки суспендируют в среде

57 2

199 на растворе Эрла с 20Х телячьей сыворотки с добавлением фитогемагглютинина в концентрации от 1: 10 до 1:100

:100, вносят в матрасы или пробирки и инкубируют при 37 С t8-24 ч. После инкубации, не переворачивая флаконы или пробирки, осторожно удаляют среду и добавляют чувствительную культуру клеток на среде 199 на растворе Эрла с 10Х телячьей сыворотки, инкубируют при 37 С в течение 3.—

6 дней. Культуру во флаконах и пробирках ежедневно просматривают на наличие изменений клеточного пласта— цитопатогенного эффекта.

Пример 1 . Диагностика вируса Коксаки В-4 из форменных элементов белой крови больного с диагнозом хронический клещевой энцефалит.

Кровь из вены больного в количестве 5,0 мл вносят в пробирку с

1,0 мл раствора гепарина (10 ед/мл), перемешивают для предотвращения образования сгустка, осторожно наслаивают на градиент фиколл-верографина, центрифугируют при 800-1000 на центрифуге К-70 (Ханс Янецки, ГДР) ,25-30 мин. Эритроциты осаждаются на ! дно центрифужного стакана, в верхней трети градиента образуется полоса клеток белой крови, состоящая на

75-SOX из лейкоцитов. Зону градиента отбирают пипеткой, разводят средой

199 на растворе Эрла в соотношении

1:3, перемешивают, центрифугируют при 1000-1200 g 5-8 мин, надосадок сливают, осадок разводят в 5 0 мл среды 199 на растворе Хенкса, промывают и центрифугируют при тех же режимах, Осадок суспендируют в среде

199 на растворе Эрла с 20Х телячьей сыворотки и фитогемагглютинином с конечной концентрацией 1:100, вносят в матрасы и инкубируют 24 ч при

37 С. После инкубации, не переворао чивая флаконы, осторожно удаляют среду и вносят суспензию клеток перевиваемой линии почек эмбриона свиньи (СПЭВ) — 500 тыс/мл на среде 199 на Эрле с 10Х телячьей сыворотки, инкубируют при 37 С 3-4 дня, ежедневно просматривая клеточный пласт на наличие деструктивных изменений, Через 24-36 ч после конфронтации культуры клетов СПЭВ с трансформированными клетками белой крови отмечали слабовыраженные изменения кле457

Тираж 687 Подписное

ВНИИПИ Заказ 9175/4

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 1045 ток. На третий день клетки значительно разрушались. Идентификация методов иммунофлюоресценции и в реакции нейтрализации показала принадлежность выделенного вируса к группе энтеровирусов и позволяет типировать его как Коксаки В-4.

Таким образом, через 3-4 дня после начала изоляции из клеток крови

10 был выделен вирус Коксаки В-4, тогда как при параллельном использовании классического метода выделения вируса из сгустка крови на. культуре ткани

1.5 были получены негативные результаты.

Пример 2. Диагностика адено вируса 1 типа из форменных элементов белой крови больного с проградиентной формой клещевого энцефалита. Кровь из вены в количестве 5,0 мл вносят в пробирки с 1,0 мл раствора гепарина (,10 ед/мл), перемешивают для предотвращения образования сгустка, наносят на градиент фиколл-верографина, центрифугируют при 800-1000 25-30 мин.

Эритроциты осаждаются на дно центрифужного стакана, в верхней трети градиента образуется полоса форменныхэлементов белой крови, состоящей из

30 лейкоцитов, лимфоцитов и макрофагов.

Зону градиента, содержащую белую кровь, осторожно отсасывают, разводят на среде 199 на растворе Эрла в соотношении 1:3, центрифугируют

5 мин при 1000 -, осадок отмывают в среде 199 на растворе Эрла, центрифугируют при 1000 5 мин и суспендируют в среде 199 на растворе Эрла с 207. телячьей сыворотки и фитогемагглютинина (1:100), вносят в мат40 расы и инкубируют при 37 С 24 ч. о

Осторожно. удаляют среду и вносят суспензию клеток СПЭВ (500 тыс/мл) на среде 199 на Эрла с 10Х телячьей сы— о - . 45 воротки, инкубируют при 37 С и просматривают под световым микроскопой. На 2-3-й день было обнаружено цитопатогенное действие, которое на

4-5-й день привело к полной деструкции клеточноro пласта. Методом им50 мунофлюоресценции и в реакции нейтрализации показана принадлежность выделенного агента к аденовирусам

1 типа.

Повышение точности способа дости I гается путем выделения форменных элементов белой крови в градиенте плотности фнколл-верографина с последующей концентрацией в 5 раз за счет уменьшения объема исходного образ-. ца крови от 5 О мл до 1,0 мл. После-, дующее увеличение числа клеток и находящегося в них вирусного агента обеспечивается при бласттрансформации.клеток крови под воздействием фитогемагглютинина, когда количество клеток увеличивается более чем в

2 раза. Общее количество клеток белой крови увелииивается, таким образом, не менее чем в 10 раз. Одновременно при бласттрансформации активируются .митотические механизмы клеток крови, которые потенциально стимулируют размножение вирусного агента, при этом соответственно повышается эффективность способа их изоляции.

Сепарация клеток крови в градиенте и освобождение от эритроцитов, гемоглобин которых оказывает неблагоприятное воздействие на культуры клеток, обеспечивают полное устранение токсического эффекта. Последующая конфронтация- чувствительных культур клеток, служащих адапторами вируса, с трансформированными клетками белой крови обеспечивает эффект чувствительности предлагаемого способа не только при выделении вирусных агентов, находящихся в активном состоянии клеток, но и дает возможность изоляции их в случае тесной связи с клеточными структурами или состояния репрессии, открывает возможности и пути обнаружения.и активации агентов, встроенных в геном клетки хо-. зяина. Таким образом, выделение чистой фракции клеток белой крови, не обладающих токсичностью, с последующей их бласттрансформацией, приводящей к увеличению исходного числа клеток и усиливающей их митотическую активность, позволяет при конфронтации с культурами клеток изолировать вирусные агенты, находящиеся в материалах в малых концентрациях или даже в неактивном, связанном с клеткой зарепрессированном состоянии и тем самым более точно ставить диагноз о наличии вирусной инфекции.