Способ исследования жизнедеятельности @ -клеток

 

СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ L -КЛЕТОК путем культивирования L,-клеток, маркирования их пизосом внеклеточным веществом с последующим электронным тиикроскопированием , отличающийся тем, что, с цельюизбирательного разрушения маркированных клеток, маркирование проводят добавлением в питательную среду 2,5-3,5 мл суспензии твердых частиц магнитита с диаметром 8-10 нм, с концентрацией 10 -1О частиц/мл, промывают немагнитной средой далее воздей ствуют на культуру «леток неоднородным магнитным полем с индукцией в области монослоя 1,О-2,р Т . (Л С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

3(5}) Cj 01 М 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

AO ДЕЛАМ ИЗОБРЕ ГЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3381305/28-13 (22) 09.02.82 (46) 15.08.83. Бюл. % 30 (72) Й.Ю. Сабаляускас, P.Ï. Кузма, В.A. Расюкявичюте, В.Г. Бендикене, А.A. Ясайтнс и .Ю.Н. Скибин (7 1) Вильнюсский государственный ордена Трудового Красного Знамени и . ордена Дружбы народов университет .им. Капсукаса

l(53) 616.07 (088.8) (56) 1. H.G.Hers and F. van Hoof, Lysosomes and storage diseases.

Academic Press, Кеи Jork, р. 173, . 1973 (прототип) . с

ÄÄSUÄÄ 1035519 A (54) (57) СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ

ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ L -КЛЕТОК путем культивирования (, -клеток, маркирования их лизосом внеклеточным вешек вом с последуюшим электронным микроскопированием, о т л и ч а ю ш и и с я тем, что, с целью избиратепьного разрушения маркированных клеток, маркирова». ние проводят добавлением в питательную среду 2,5-3,5 мл суспенэии твердых частиц магнитита с диаметром 8-10 нм, с концентрацией 10 9 -1010 а диц/мл про мывают немагнитной средой далее воэдей. ствуют на культуру клеток неоднородным магнитным полем с индукцией в области монослоя 1,0-2,0 Т .

10355 ится к биологии и е в цитологии, ге- избирательное ра х клеток, стигается тем ° что 25 следования жизнедеяутем культивироваования их лизосом вом с последующим опированием маркиро- 30 ением в питательсуспензии твердых иаметром 8-10 нм, .

10 " частиц/мл, ой средой, далее возу клеток неоднород35 с индукпией в об

2,0 T.. спользуют клетки лирлом в результате ных фибробластов

40 антреном в культуре. ьтуру мышиных I„— ри 37 С на покрово

Т -199, дополненсывороткой, добавля45 твердых частиц магдкости в воде и с астиц/мл. После 80ч еток два раза промыедой без магниточув- 50 . После адгезин кле» араты префиксируют н 2,5%-ным раствором в 0,1 М фосфатном

ывают в течение 55 тным буфером рН 7,4, ение 1 ч 1%-ным ,1 М веронал-ацетат1

Изобретение отно может найти примене нетике и медищтне.

Известен способ деятельности L -клет вания L клеток, мар внеклеточным вещест электронным микроск

Однако прим енени недост атк ов, TBK K B K

IoT постоянного хими электронным микроск

ИХ МОЛЕКУЛЫ K8K TBK мер ферментативно а вариваются самим ли третьи проявляют ка

Все эти вещества о состояние зависит от ствием лизосомной с

Кроме того, изве печивает избиратель кированных клеток.

Бель изобретения рушение маркированн

Указанная цель д согласно способу ис тельности L, -клеток ния. I„-клеток мар внеклеточным веще электронным микрос ванне проводят доба ную среду 2,5 -3,5 частиц магнитита с с концентрацией 10 промывают немагнит действуют на культ ным магнитным пол ласти монослоя 1,0

Пример 1. нии 1., полученной трансформации норм мьпней 20 -метилх

Пересеваемую к клеток выращивают ных стеклах.в среде ной 10%-ной бычьей ют 2,5 мл суспензия ниточувствительной концентрацией 10 роста монослой l.вают питательной с ствительной жидкос ток к субстрату пре в течение 45-50 глутарового альдеги буфере рН 7,4, про

30 мин 0,1 N фосф постфнксируют в те раствором ОЭ о 4 а сследования жизнек путем культивироования их лизосом ом с последующим пированием jl ). . маркеров имеет ряд одни из них не име- 10 еского состава и под пом нельзя выявить вые, другие (напри» тивные белки) переосомным аппаратом, ерогенное действие. i аются в клетке и их превращений под дейтстемы.

iN способ не обес- 0

oro разрушения мар19 Ъ ном буфере рН 7,2. Обезвоживание осуществляют в серии спиртов возрастающей концентрации от 50 до 100%. После выдерживания в смеси абсолютного спирта с ацетоном- (1:1) объекты переносят в абсолютный ацетон, а затем в смесь абсо. лютного ацетона с аральдитом (1:3), в смесь абсолютного ацетона с аральди— том (3:1). После полимеризации смолы монослой L-клеток отделяют от стекла в жидком азоте. Срезы для электронной микроскопии приготавливают на ультрамикротоме, контрастируют 3%-ным раствором уранил-ацетата в этиловом спирте и просматривают под электронным микроскопом, после чего префиксацию и все после.дующие операции проводят согласно примера 1, Твердые ферромагнитные частицы, со держащиеся в магниточувствительной жидкости, являются однодоменными со сред-ой ним магнитным моментом m-3,4 10 1 с/см =

3,4 ° 1 0 " A. м 2, электронно-оптически плотными. Сочетание этих свойств позволяет не только ускорять их в магнитном поле, но н наблюдать места их сосрепоточення в живой материи.

Электронно-микроскопическое исследование препаратов показывает, что твердые ферромагнитные частицы после культивирования сосредоточены в лизосомах l„клеток.

Пример 2, Монослой L, -клеток с твердыми ферромагнитными частицами в лизосомах, полученный согласно примеру 1

° после префиксации, помешают в.неоднородное магнитное поле (тип магнита ФЛ-1) индукцией 1,5 Т в области монослоя и выдерживают в,течение 6 с, после чего префиксацию и все последуюшие операции проводят согласно примеру 1.

Под воздействием магнитного поля фер- ромагнитные частицы, находящиеся в лизосомах („ -клеток, ускоряются до такой степени, что разрывают лизосомные мембраны и тем самым разрушают клетки, лизосомы которых маркированы магнитными . частицами.

Просмотр под электронным микроскопом показывает, что лизосомные мембрат ны разрушены, т,е. жизнеспособность клеток нарушена, они практически погибают.

Аналогичные результаты получены при объеме магнитной суспензии 3,0 и 3,5 мл и концентрации магнитных частиц 10"очастиц/мл облучении магнитным полем с индукцией 2 Т, При объеме ниже 2,5 мл и концентрации ниже 10 частиц/мл способ неосушест

Составитель Н. Хрусталева

Редактор В. Ковтун Техред Т.фанта

Корректор A. Повх.Заказ 5824/45 Тираж 873 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Г-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 10355 19 ° 4 вим из-за недостаточности количества фер. дыми ферроматчштными частицами, разруромагнитных частиц для эдоцитоза их в шаются как индукцией в 2 Т, так и ин- . лизосомы I„-клеток. Увеличение объема дукцней 3,0-4,0 Т одинаково. Поэтому выше 3,5 мл и концентрации выше 10 час увеличение индукций не целесообразно иэтиц/мл приводит к значительному сниже g за расходов энергии. нию роста L -клеток из-за перенасыщения Использование предлагаемого способа питательной среды твердыми феррома-нит сокрашает расходы, снижает токсичность ными частицами. маркеров, используемых для идентифнкаИнтенсивность индукции магнитного по- ции H выделения лизосом. способcTBó ля ниже 1 Т не способствует разрушению to избирательному разрушению клеток, лизоклеток, а выше 2 Т неэффективна, т.е. сомы которых предварительно загружены" клетки, лизосомы которых загружены твер ферромагнитными частицами.