Способ определения концентрации физиологически активных веществ

 

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ. АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ, заключающийся в электролизе исследуемого раствора в присутствии глюкозооксидазы, содержащейся в приэлёктродном слое мембраны, измерении тока и определении концентрации по изменению тока, отличающийся тем, что, с целью обеспечения возможности определения концентрации аденозинтрифосфата, в призлектродный слой мембраны дополнительно вводят иммобилизованную гексокиназу в буферном растворе трис-НСР, , содержащем сульфат магния и тгйокозу, а концентрацию аденозинтрифосфата определяют по уменьшению анодного тока . 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения чувствительности определения, глюкозооксидазу уводят в количестве g

„„SU„„1035498

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПИГИ Н здп G 01 и 27/52.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 1"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3368136/18-25 (22) 08. 12. 81 (46) 15. 08.83. Бюл. У 30 (72) Ю.Ю. Кулис М.В. Песлякене, В.-.С.А. Лауринавичюс и В.С. Травкина (71) Институт биохимии АН Литовс кой ССР (53) 543.257(088.8). (56) 1. Имшенецкий А.А. и др. Оптимальные условия . определения АТф микробного происхождения. - "Микро" биология", 1977, т. XVi, вып. 2, с ° 277.

2. Патент США и 3539455, . кл. 204-4, опублик. 1970 (прототип). (54) (57) 1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ФИЗИОЛОГИ4ЕСКИ АКТИВНЫХ

ВЕЩЕСТВ, заключающийся в электролизе исследуемого раствора в присутствии глюкоэооксидаэы, содержащейся в приэлектродном слое мембраны, измерении тока и определении концентрации по изменению тока, о т л и ч а ю " шийся тем, что, с целью обеспечения возможности определения концентрации аденоэинтрифосфата, в приэлектродный слой мембраны дополнительно вводят иммобилиэованную гексокиназу в буферном растворе трис-НСР;, содержащем сульфат магния и глюкозу, а концентрацию аденозинтрифосфата определяют по уменьшению анодного то" ка.

2. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения чувствительности определения, глюкозооксидазу вводят в количестве (1,5-3,0) 10 ед/см, а иммобилизованную гексокинаэу - в количестве (3-6) 10 ед/см в 0,009-0,01.1 М буферном растворе т)>Ос -HCP, содержащем С

2-4 мМ сульфата магния и О, 1-0,2 мМ глюкозы. что согласно способу определения кон. центрации физиологически активных веФ 1035

Изобретение относится к контроль-. но-измерительной технике, предназначено для электрохимического определения концентрации физиологически активных веществ аденозинтрифосфата (АТФ) при помощи ферментных реакций, и может быть использовано в медицине.

Известен способ определения аде- . нозинтрифосфата, заключающийся в реакции окисления люциферина в присутст-!О ч g+ вии адеиозиитрифосфата и солеи Мд катализируемой люциферазой, Реакция сопровождается выделением света, ин- тенсивность которого пропорциональна концентрации аденозинтрифосфата f!).

Недостатком данного способа явля"

: ется ограниченное его применение, поскольку используемые при этом люци" ферии и люцифераза выделяются из на" секомых, а хемилюминесцентная уста- 20 йовка сложна, измерения проводятся лишь в периодическом режиме. Так, лиофилиэованный экстракт из хвостиков светляков фирмы "Серва" растворяется в 5 мл бидистилята в течение

1 мин и помещается 8 лед. Рабочий раствор готовится, непосредственно перед проведением измерений, О,! мл исходного экстракта добавляется в

0,9 мл буферного раствора ГБПЭС0,25 И (рН 7,5}, содержащего NgSO 1О мИ и проводится определение фона (0,3 мин) . После введения образца

АТФ определяетСя свечение в течение

1 мии, При каждом определении используются новые порции экстракта.

Наиболее близким к изобретению является способ определения концентрации физиологически активных веществ, заключающийся в электролизе исследуемого раствора в присутствии глюкозо40 оксидазы, содержащейся в приэлектродном слое мембраны, измерении тока и определении концентрации по изме-нению тока (.2). Способ позволяет on"". ределить концентрацию глюкозы. Нахо- 45 дящаяся в анализируемом растворе глю" коза, диффундирует в слой глюкозооксидазы, где а реакции с кислородом образуется перекись водорода, которая электрохимически окисляется на поверхности электрода. Количество об-разовавшейся перекиси водорода определяется концентрацией глюкозы и таким образом измеряемый ток зависит от ее концентрации. 55

Однако. известный способ не позволяет определить концентрацию аденозиитрифосфата.

498 2

Цель изобретения - определение концентрации аденозинтрифосфата.

Поставленная цель достигается тем, ществ, заключающемуся в электролизе исследуемого раствора в присутствии глюкозооксидазы, содержащейся в приэлектродном слое мембраны, измерении тока и определении концентрации по изменению тока, в приэлектродный слой мембраны дополнительно вводят иммоби" лизованную гексокиназу в буферном растворетрЖ -НСР, содержащем сульфат магния и глюкозу, а концентрацию аденозинтрифосфата определяют по уменьшению анодного тока.

С целью повышения чувствительности определения глюкозооксидазу вводят в количестве (1,5-3,0) ° 10 > ед/см, а иммобилизованную гексокиназу - в количестве (3-6) ° 10 ед/см" в 0,0090,011 M буферном растворе Трис-НСГ, содержащем 2-4 мМ сульфата магния и

0,1-0,2 мМ глюкозы.

Приведенный нижний предел концентрации гексокиназы является существенным, если аденозинтрифосфат присутст" вует в небольших концентрациях. Так, например, при уменьшении концентрации гексокиназы до 2 10 ед/см чувстви-. тельность устройства уменьшается и нижнюю концентрацию АТФ - 0,035 мМ . определить невозможно. При выходе из верхнего предела концентрации гексокиназы увеличивается толщина мембранного слоя, чувствительность электрода уменьшается и определить минимальную концентрацию аденозинтрифосфата невозможно.

По аналогичным причинам нельзя выходить .за указанные пределы концентраций глюкозооксидазы.

От рН зависит активность ферментов, а соответственно и чувствительность электрода. Выход за пределы данного интервала значений рН приводит к уменьшению активности электрода„ и определить нижний предел концент.рации АТф невозможно. Так, уменьшение концентрации буферного раствора ниже

0,01 И не обеспечивает стабильного рН всей системы, что уменьшает стабильность чувствительности электрода.

Увеличение концентрации буферного раствора ведет к образованию значительного остаточного тока, что приводит к нестабильной работе электрода.

3 1035"98 4

Не обеспечивается точное определенйа во всех концентрациях (не созданы аденозинтрифосфата в минимальных кон- оптимальные условия действия фермен" центрациях. тов) .

По аналогичным причинам даны оп- Способ определения обоснован слетимальные интервалы концентраций суль- 5 дующими ферментативными превращения" фата магния и глюкозы. ми.

Большие концентрации аденозинтри- Под действием глюкозооксидазы окис" фосфата возможно определить и не в ляется глюкоза, образовывается Н О оптимальных количествах ферментов, а электрохимическое окисление послед-... т.е. допустимо любое соотношение ве- щ ней при +0,6 В от электрода сравнения ществ, но тогда не обеспечивается точ- (насыщенный Ag/AgÎ ) генерирует анод-. ное определение аденозинтрифосфата ный ток глюкозоокси аза глюкоза + О g-глюконолактон + Н О

При наличии гексокиназы и аденозин форилирование глюкозы с образованием трифосфата параллельно протекает фос- аденозиндифосфата (АДФ) l глюкоза + Атф 2 озо-б-Фосфат + АДФ гексокиназа

И924

Таблица 1

САТЕ- И

САту»

0,035 мкА/см

Ю и д1, мкА/см

0,24 0 р 735

P 29 0,825

0,33 0,921

0,40 1,107

0,43 t 146 урцс-НС2 буеере (pH 7,2), содереееем

4 мИ сульфата магния и 0,2 мИ глюкозы. Снимают показания электрода во время его эксплуатации при рН 7,2, 25 С, +0,6 В.

Изменение чувствительности электрода при его эксплуатации показано в табл. 2.

0,075

0 180

0,330

0,480

0,630

0,70

0,12

0,16

0,21

Коэффициент чувствительности

3,06 мкА/см мИ АТФ, предел обнаружения АТФ - 2,7 10 И.

Пример 2. Электролиз исследуемого раствора проводят в присутствии 3,0 10 ед/см глюнозооксидазы и 6 ° 10 ед/см гексокиназы в 0,01 М

В результате фосфорилирования глюкозы анодный ток падает. Степень уменьшения тока пропорциональна концентрации АТФ.

Для осуществления способа приме- . няется электрод,.содержащий глюкозооксидазную и гексокиназную.мембраны, т.е. ферменты захвачены в приэлектродном слое. Активность используемой. иммобилизованной глюкозооксидазы составляет (1,5-3) 10 ед/см (толщина слоя 0,1 мм), а гексокиназы - (3-6)

° 10 ед/см (толщина слоя задана капроновой сеткой из нитей диаметром

0,1 мм) . 35 .При погружении электрода в буферный раствор, содержащий глюкозу, генерируется анодный ток в результате окисления Н О . При наличии АТФ количество Н О< уменьшается из-за па- 40

Фраллельного фосфорилирования глюкозы. и, следовательно, наблюдается умень- шение анодного тока. Способ включает следующие операции: электролиз ис" следуемого раствора, измерение тока

ы определение концентрации аденозинтрифосфата (АТФ).

Пример 1. Электролиз исследуемого раствора проводят в присутствии 1,5 10 ед/см глюкозооксидазы, 3 10б ед/см гексокиназы в 0,01 М ñ-НС8 буфере (рН 7,0), содержащем

2 мИ сульфата магния и 0,1 мИ глюко-:. зы. Определяют стационарный ток электрода в зависимости от концентрации аденоэинтрифосфата при. рН 7,0, 25оС +0,6 В.

Зависимость анодного тока электрода от концентрации АТФ приведена.. в табл. 1.

1035498

Т а б л и ц а 2

Я

Ь1 мкА/см

C мИ

Атф через 24 часа после изготовления. непосредственно после изготовления электрода через 48 часов после иэготов" ления

0,078

0,12

0,24

0,150

0,240

0,300

0,32

0,44

Сост а ни тель 0. Але ксее ва

Техред А.Бабинец Корректор Г. Реаетник

Редактор В. Ковтун

Заказ 5822/44

Тираж 873 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

« филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

0 330

0 735

0 921

1, 146

Из таблицы видно, что электрод, содержащий глюкозооксидазу и гексо"

«20 киназу, пригоден для определения аденозинтрифосфата в течение двух суток, Ь ходе которых выполнено 1000 определений.

По сравнению с известным способом определения концентрации аденозин" трифосфата предлагаемый дает воэмож0,225

0,450

0,600

0,750 ность определения более 1000 проб одной порцией фермента. Кроме того, отпадает необходимость в использовании люциферина и нестабильной и дорогостоящей люциферазы, отсутствует необходимость использования сложной установки, возможен непрерывный контроль уровня АТф и снижается стоимость определения.