Способ получения личинок геогельминтов

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИЧИНОК ГКО-ГЕЛЬМИНТОВ, включающий выделение из самок нематод яиц, культивирование яиц на питательной ереде и 6тделение вышедших личинок, о т л ич a ю itt и-й с я тем, что, с целью повышения выхода личино к, перед выделением яиц самок Нематод помещают в 3-5%-ный раствор; fi -диэиламиноизобутирони .трила на 2-4 ч.

СОЮЭ иОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

И5П А 01 К 67 00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМЪ СВИДЯТЕЛЬСТВЪ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ. ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21 ) 3387010/30-15 (22) 10.12.81 (4.6) 30.05.83.. Бюп. В 20 (72.) И. A. Садыхов р Р. И. Ахмедов и E. М. Ханбекова (71) Институт зоологии АН Азербайджан« ской ССР . (53) 576.8 ° 093.1(088.8) (56).1. Кротов A. И. Содержание и культивирование паразитических нема-. тод в искусственных условиях. "Успехи современной биологии", 1958,- 46, М 2, с. 230 -239.

: 2. Петров A. М., Гагарин 3. Г.

Методы культивирования яиц и личинок гельминтов. Лабораторные методы исследования в ветеринарии, 1953, т.1, с. 341-351.

„.SU„„4 А (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИЧИНОК

ГЕО-ГЕЛЬИИНТОВ, включаюедй выделение из самок нематод яиц, культивирование яиц на питательной среде и отделение выцедших личинок, о т л ич а ю щ и.й с я тем, что, с целью повышения выхода личинок, перед выделением яиц самок нематод помещают в 3-5%ньтй раствор 9 --дизтиламиноизобутиронитрила на 2-4 ч.

1020104

Изобретение относится к ветеринарной,гельминтологии, в частности к культивированию личинок нематод в лабораторных условиях при изучении экологии экзогенных стадий развития нематод, влияпия физических факторов среды и разработки новых методов профилактики нематодов сельскохозяйственных животных.

Известен способ получения личинок гео-гельминтов в лаборатории, кото- 10 рый осуществляется следующим образом яйца, полученные из фекалий методами, .флотации или осаждения, или яйца, полученные из гонад самок путем потрошения,. помещают в оптимальные для развития . 15 условия, используя в качестве среды воду, воду с фекалиями, .опилки и др.

Через определенное время (в зависимости от условий культивирования) выходят личинки, которых надо различ- 0 ными способами собрать, очистить от частиц среды и микрофлоры антибиотиками, перед посевом на новую чистую среду для дальнейшего культивирования провести подсчет, отобрать необходимое кх количество )1).

Недостатками способа являются трудоемкость и низкий выход личинок.

Известен также способ получения личинок гео-гельминтов, включающий выделение из самок нематод яиц, куль- З0 тивирование яиц на питательной среде и отделение вышедших личинок $ 2) .

Недостатком данного способа является малый выход личинок, так как при промывании их антибиотиками и 35 водой и переносе в другую среду часть . личинок теряется в период культивирования, Цель изобретения — повыаение выхода личинок гео-гельминтов.

Поставленная цель достигается тем, что перед выделением яиц самок нематод помещают в 3-59-ный раствор

-диэтиламиноизобутиронитрила на

2-4 ч. р -Диэтиламиноизобутиронитрил оказывает стимулирующее действие

ыа яйца в гонадах живых самок. Через

1-1,5 сут после гибели самок в воде при 19-23 С в тело ее выходят активные личинки. Они питаются внутренними органами, продвигаясь к вульварному или ротовому отверстиям, через которые могут выходить во внешнюю 55 среду. Кроме того, при переносе самок из раствора в воду на них оста.ются частицы р -диэтиламиноиэобутиронитрила, который ингибирует развитие микрофлоры в среде культивирова- 60 ния. ," -Диэтиламиноизобутиронитрил относится к химическому соединению, в частности к Р --М-(диалкил) эамещен- 5 ным йасыщенным алифатическим аминонитрилам изостроения, и имеет формулу

6Н> Нр

N-1н;dH — бБ

OH q— d?4 6<

Г

Структура р -диэтиламиноизобутиронитрила подтверждается результатами

ИК-спектроскопического анализа.

В спектре соединения отмечаются полосы (см ) диэтиламинной.группы:

Ен3 бн2

/ бНз — Н g

780, 949, 1010, 1080, 1140, 2825, 2880, 2940, 2980, 3200, 3450 и изобутиронитрильной группы: бн2 бн eN бн

830, 940, 1280, 1380, 2250, 2825, 2880, 2940, 2980. Подчеркнутые полосы имеют нахождение полос второго фрагмента.

Все эти полосы, имеющиеся вприлагаемом ИК-спектре, подтверждают структуру р диэтиламиноизобутиронитрила, который образуется в результате присоединения диаэтиламина к метакрилонитрилу (см. чертеж).

Съемка проб производится на ИКспектрофотометре ИК-20 ("К Цейсс"

Иена). Прозрачный жидкий образец снимается без растворителя в герметичных стандартных кюветах из KB r c толщиной 40-54 мкм.

Испытание соединения s качестве стимулятора развития яиц и выхода личинок геогельминтов и ингибитора мйкрофлоры в лабораторных условиях проводят в чашках Петри на гельмин-. тах из родов Тг)сЬеЫгощЯцз, йвea%ttodirus И1агзЬоИод.4а и видов Носп оисМь contp Kus и ОМеи од а

Ыг сои сюс Ьо

Гельминтологический материал собирают иэ кишечного тракта овец и хранят до начала опытов (3-4 ч) при

28-32 С в термосе с физраствором.

Растворы р -диэтиламиноизобутиронитрила готовят в дистиллированной воде в объемных процентах.

Всего поставлено 15 опытов в трех повторностях, пяти вариантах. В каждую чашу Петри вносят по 10-20 самок одного из названных видов нематод, в гонадах которых имеются зрелые яйца. По окончании экспозиции 70% самок, не отвытых от раствора, переносят g водопроводную дехлорированную Воду. Контролем служат самки тех же видов, не обработанные раст1020104 вором р -диэтиламин зи зобутнронитрила., . содержащиеся в тех же условиях.

Температурные условия опытов19"23 С.

Наблюдения за поведением и развитием объектов. проводят с помощью бинокулярной лупы ЩБС-1 и микроско па ИВР-1. дважды в сутки.

В период массового выхода личинок в. теле самок обнаружено 16-25, живых активных личинок. . 10

П р н м. е р 1. Стимулирование развития яиц и личинок в самках

Hacmonctes саббат Ыэ.. Живых самок гемойхов помещают- в чащки Петри с водным раствором р -дизтнлаыиноизобуткро45 нитрила 3 и 54-ной концентраций на1, 4 и 21 ч. По окончании экспозиции самок, .еще живых, переносят (не отмывая) в 60. мя водопроводной воды (703 самок). Через 24:ч самки гибнут, щ а.через 48 ч после начала опыта иэ яиц внутри тела самки начинают Вв -ходить личинки. I стадии,. активно двн гаясь в передний отдел тела. Наиболее массовый выход их иабякЩаЕтоя Ри.. экспозиции в растворе 4 ч и 5%-иой концентрации раствора в дехлорирован-: ной воде при 19-23 С. Начало выхода личинок - конец первых суток после гирелн самки.

Стимулирование развития яиц прн помощи Р -днзтнламиноиэобутиронитрила происходит только в гонадах живых самок (табл. 1, пункт 1).

П р и и е р 2. действие раствора

-дизтиламнноизобутироннтрила на . самок н яйца в них:из рода ÑÌ8

Ьоп(рРмэ . Иэ табл. 1 (пункт 2) видно, что стимулирующее,действие раствор. оказывает также на аивых самок нематод.

Живых самок трихостронгилнд помещают в 2 и 5%-ные раствсры биологически активного вещества на б сут,. 3 и

4 ч, затем, не отънаая, s водопроводную декорированную воду (табл . 1.)..

Наблюдения показали,.что длительная экспозиция савюк в растворе препятствует дальнейшему развитию яиц - они гибнут. Наиболее эффективны условия экспозиция самок в растворе 4 ч при концентрации в объеме 5% и 19-23 С.:

Через 1-1,5 сут после гибели самки в полость ее тела. выходят личинки.

zozo>o<

+ 1 н

) +

П I> 11

П Il П Я

+ о

+ н п ьь

I I о

Х I

Ж I

CO

I w

Ц 1 ц(—

О о о Х

t 1

П П И

O l

)Х! П

1 Я t ! gl,1 Ф

1 I с«ь

1 Х I

П Еь И о Х

1 +

). I

Х! о! о

I Ж

1 &

I O о пь о пе o

В Э

Э Ц о

1 Р

1 «Ф

I е ———

Н И

П о! 1 1

1 1 1

ХЕХ)

ФХФ) ь)1

ЕьЬ Еi 1 Е:АР l

m! t йО.е

ПЬО). Ха

Е.Ь а, В,t ЬЬЬ а - l

4 g Ф ьье хрясь

1 о 25ьп

«и ь..

Ф 4L 6) . "1

e & I р,o

6 о

5 х х х

° ° ° о о о с«ь C«3 c«t х х ьл ch о х х

° ° е-ь ю о о х ) 1 «

СО о

4 ь ььь !

1 I

1 I

I !

t« I

l f

1 !

1 t! ) е х

1 > I +

Е Х

I Рэ +

I I

Х Е 1

Х I

g4 ььь 1 ььь t X

Х 1 М 1 1 +

РХ ьП 1 Э )о I +

Ь ° ОЯ) Х)м аХХ) ь)1, охх t аь П«Ф 1 ьП 1

Хо)

og i х t х ьь) Х 1 Х t 5 t + цхl e I

ОЦ) Xь«"ь 1

Ф!Я I )

vol 8

П

1 - -к х и к

Фх1 А5 м

1 !

I

1

О о

1 CV

I

1 ш ю I м th ю, щ EA tA Ръ (ч

1 с-!

Д..t, I

I ь о

1 ! о . I

I 3» в 1

3 U 1

1 »А

l.

1

1 .I»

I . 3! Q.

3 .. I <"Ъ

1 ! х .! R.l 3I 1 Ь

Ф 1 1

I Х1а

3 К I 3

t I ! Ц .!. о !,х!

l3I 3

1 3!3 I, 1 .1 э

1 Х t m

1 1

I М 1; 1

О1

1 $1 Р" I

I О3ч I

I "I3 М н 0 о

1 X.1 М ! !33 I и . !.3 х

C InI

» !,!

З 1

3

t

I

1

1 3»

I и

l А!3 I

I Щ

1 »

1 3 б-.— —

R I ок

Х и ! 3!б йУ ! !

\ !

I Ф 1

1 a,Í 1 !

ОЙ t

Ж. C

1 Эя

Ф К.аб

ОХ О 1

ХDIQ !

Ф !.!

I 3 о

1 .д 1

1 g

I Ф 1

I 33

I а

1020104 р + + х

В4 .Х +

+ о х о

3 < Ъ W 6Ъ I

1 ! °

I Ф

I и

l и

t Ф.

I 33

3 Ф

1 . 3

3 М

I ! я

1 3:»

3

I!!б

Ре

Ю

lg

3»

34 о

Х 1 !

33 о х

М ф

C)

СО

«г

00 4 х х

° ° о °

РЪ IA

I е

3 lC

1 О I: б 3 Ф

I и

1

М

3 Ю

3 Х

I 33

I I 3

1К

l ° . 33 а о. ! С» 4

1 1 13Ф

I О К Ф

I 34 Ю 3»

ttl 63

3 Ж Я. 33

Х 33O X- -O

Х I

I О Ф. Ю

М Ф Ф

1х.о а н

1 О И В. и ! 3 . 4!3 33 х х t e я

+ +!o и ям

I Ж в

3 М Ф I» X

I. I» !tI Ф Ф ! о р ц

++1 об!й

+ + I и 33 О

+ + 3. 333 g Ф и ба 3- 2 К

l. !33

I 4Ф Ф К 33

+ +бо х Ф ц.

+ + I L Ж 3» О .

+ + I sO Х Х ,о и

l Ф М 3» Ilt

I 3» К Ф ба 33 О

I Н О Х

+ + I .3» 3. 333

+ + l A Ж и ! м ф о

I Ф I к х

3 3 !33 Ф -Ф

I a g 3 3

I Q 3» 333 33

I. I .I I I

1 1 l 1

3+ Фф ! + с) 5

3 -и «

% «

+

I 3 + Х О

° ° ° ° ! » Е 3 Ъ В

1020104

Прн уменьшении экспозиции до 3 ч время начала выхода личинок увеличивается до 4 сут.

Пример 3. Самок ОэМ)tcqpa

e

Лучшими условиями для выхода личинок остертагнй в теле самок при

19-23аC можно считатьг :концентрацию

-диэтиламиноизобутиронитрила 5%, экспозицию самок в растворе 3 ч, среду культивирования — дехлорированную воду. Выход личинок наблкща.ется через 1-1,5 сут после гибели самок.

Пример 4. В тех же условиях изучается действие растворов р -ди.этиламиноизобутнронитрнла на самок нематод из рода Мо з%аИоц. а и Йепа—

&оИги6 . Взрослые паразиты после действия раствора гибнут в те же сроки, что и описанные виды. В теле погибшей самки в течение первых трех сут идет развитие яиц, но затем оно прекращается и яйца гибнут. Для этих видав гельминтов свойственно длительное развитие яиц и личинок в них1 или 2 линьки протекают B яйце. Личинки в теле самки для этих видов нематод не получены.

Стимуляция развития.яиц и выхода

10 личинок внутри тела самок 8 -диэтиламиноизобутиронитрилом возможна для нематод стронгилоидного типа развития.

Пример 5. Во всех опытах при 5 наблюдении за. развитием яиц в теле самки нематод учитывается также степень развития микрофлоры по сравнению с контрольными вариантами (самки нематад, содержащиеся в чашках .О с декларированной водопроводной водой, не подвергающиеся действию (-диэтиламиноизобутиронитрила).

Инагократные наблюдения показывают, что 7-15 самок, не отмытых от 5%-ного раствора Р -диэтиламиноизобутироннтрила, перенесенные в 60-8Ь мл воды, содержат достаточное количество вещества, способного подавить рост микрофлоры в среде культивирования.

В течение первых трех суток рост микрофлоры иигибируется полностью, в последующие 4-б сут развивается единичное число микроорганизмов и только спустя 7-8 сут в среде культивирования появляется незначительное их ко35 личество, не мешающее развитию личинок (табл. 2).

1020104

+ +

+

I

l ++

1 ++

+

I

I l + +

3 1

+

+ + +

1 1 I

3

3

i 3

1- ++

I ++

1.

+

1.

l . +

1 + ! ++

I

3

I - +

3 +

+ +

I .

1

3 +

1 +

I +

+

1!

+ + +

1 !

1

I

3 +

3 +

1 (°

+ +

I. I

1 1

I

l !

11 "+ I. I ..

I. l

++

+ + ! .+.А 3

Х 3

Ф 1

Ф I Р .31. О

1 . I

t М

3 g

1 Ж .t e

I !3

1 X о

t. !

Ц !

И

1 н 1

1 .А

3 !! Д 3. а О .ое н ю Ф но

O Qw, NI

Ь3 9 O 0

» н!

Cl

lA о н ь с о о

1 сч i !о

1 1 н н

I 1

Ф 1 3 ! 1

I I и I - I

I I Щ о

Ц 3 I

3 р

t . I

33 1 I

I I Еч 1 1 сЬ

I 1;

1 1

1 Г.

I I

l 53

1 ф 3 3» ! t. ! Ов—

I t ! I

М I .I РI щг.О I

1 Е 3.

1 О.3

l5 Д, Ц t x

F4.3 М 1

Н:.I

Ж 1 и I.lh 1О а 1 1 о 1н! ф I й! .i1 В i

tel.

I. Р 1. о:

Р) 1 41w и

33!Н! о 1о!

33 О.i

3: "u i

М. Ж I.

Н 1 Ф 1.В 3 Н м ъ.

5 !х!

-.1.. I

I 1

Ф- 1 — -.

1 I:

33 1. Ф

Р I 1 о

133 1 . I

El.

Ф .,I

A 1 t, 1 )..

Р3 1

Н3 (Ч

3. ..I l Phj I I 1

О 1

Д L.O 1 *

1

1 ) I. 1 1 1

1 I I I .1

1 1 .. 1 1 о ь- о о ъ ъ ° .ъ С

3Ч- .Е Ю

1 !

i

t !

1

f 1

3 а !. Q;

1 !4

1 Ф

+ 3ф о1 И

I Ф

+ 1 . N

1 l g .

3 а

1 О. о

1 g, 1

1 Ф

1 I Ж : Ф 43 .

t . Ф В .

З 33> о а 3 О. О3 ! В eked

1 Й l4М

I 3

1 .3 !

l .! +

3.! 1

° е ° ю cv ee !

Ф !

33 .! е

1 а I

l и

i в

Ф

Ф О

Ф

33 3 о

Q н х о

2. 3

gìv. р м о g

Ф 3 3;3 оо

Р 33. Ф g Мдо

1 1 1

1020104

Составитель М. Белоусова

Редактор П. Макаревич Техред A. Бабинец Корректор Ю. Макаренко

Й И Юв

Подписное

Заказ 3749/5 Тираж 721

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, й-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

В связи с этим проводят испытания различных концентраций (от 0,01 до

5,0% ) р -диэтнламинонзобутироннтрила как ингибитора микрофлоры. Результаты испытаний, представленные в табл.2, "подтверждают проведенные наблюдения. 5 р -Диэтиламиноиэобутиронитрил, стимулируя развитие яиц в самках нематод, одновременно ингибирует в среде куль.тивирования развитие микрофлоры.

Применение преднагаемого способа t0 обеспечивает ряд преимуществ в сравнении с известным, Во-первых, так как яйца развиваютсй в полости тела самки, исключается процесс потрошения и их сбор, отнима- )$ ющий, как правило, большую часть вре-.

МЕни при поотаНОВКВ ОпЫтов (2-3 рабочих дня . Кроме того, отпадает необходимость работы с микроскопическими объекТами, so-вторых, после гибели

«самок под действием P диэтиламяноичобутиронитрила в гонадах развиваются все зрелые яйца, исключена возможность их механического повреждения, обеспечен учет дефектных и незрелых яиц;

s.-третьих, нет необходимости очищать среду от .остатков тел нематод, которые, как правило, служат пищей гнилостйой микрофлоре, кроме того, на этом этапе экономится время, в-четвертых, исключается процесс открывания личинок и очистка среды от избытка микрофлоры, так как.даже в очень незначительных дозах в -диэтиламиноизобутиронитрнл сам ингибнрует рост микроорганизмов, а значит, отпадает потребность s антибиотиках и экономится время, в-пятых, так как личинки сконцентрированы в теле нематоды, исключается учет личинок неизвестного вида, что важно для диагностики личинок на разных стадиях развития этот способ дает воэможность при вырацивании личинок проводить диагностику самок (видовую) °