Способ получения ксилозы путем ферментативного гидролиза водных растворов ксиланов

 

СПОСОБ ПОЛУ1 ЕНИЯ КСИЛОЗЫ ПУТЕМ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА ВОДНЫХ РАСТВОРОВ КСИЛАНОВ посредством фер- ; ментной системы, включающей ксиланазу и ft-ксилозидазу, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, .ферментативный гидролиз осуществляют при в течение 4 ч, а в качестве ферментной системы используют ксиланазу и р -ксилозидазу и, в случае необходимости , фермент, отщепляющий уроновую кислоту, раздельно иммобилизованные на неорганическом носителе, выбранном из группы: пористое стекло, силикагель или кизельгур. (О ел

СО1ОЭ СОВЕТСНИХ

Э %%%

РЕСПУБЛИК

1 (19) (11) д1),C 07 H 3/02//С 13 D 1/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ Д ъ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Ы С " "

6с ныа еибрапцз щепкиной arlpunuz

Фиг./ (21) 2532400/23-04 (22) 28.09.77 (31) Р 2643800.6 (32) 29.09.76 (33) ФРГ (46) 07.04.83. Бюл. ) 13 (72) Юрген Пулс, Михаэль Зиннер и

Ханс-Херман Дитрихс (ФРГ) (71) Проектирунг Хемише Ферфаренстехник ГмбХ (ФРГ) (53) 547,454.07(088.8) (56) 1. Kusakabe I., Yasui Т., Ko bayashi T. Новый метод получения ксилобйозы и ксилозы путем энзиматического гидролиза ксиланов растительного сырья . - "Agr. Biol. Chem." 1975, 39, И 7, 1355 (прототип). (54)(57) спасов полЖния ксилозы пуТЕМ ФЕРИЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА ВОДНЫХ, РАСТВОРОВ КСИЛАНОВ посредством фер" : ментной системы, включающей ксилана" зу и )-ксилозидазу, о т. л и ч а ющ и и с я тем, что, с целью повыше" ния выхода целевого продукта, .Ферментативный гидролиз осуществляют при

40 С в течение 4 ч, а в качестве ферментной системы используют ксиланазу и $ -ксилозидазу и, в случае необходимости, фермент, отщепляющий уроновую кислоту, раздельно иммобилизованные на неорганическом носителе, выбранном из группы: пористое стекло, силикагель или кизельгур.

1011050

Изобретение относится к усовершенствованному. способу ферментатчвного получения ксилозы, важного продукта пищевой промышленности.

Известен способ получения ксилоэы: ферментативным гидролизом водных растворов ксиланов посредством кси" ланазы Pi -ксилоэидазы при комнатной температуре в течение 6"8 ч. В ре" зультате ферментативного гидролиза

1О получают гидролизат, содержащий ксилозу и ксилобиозу в соотношении

1:1 (13.

Недостатком известного способа является низкий выход целевого продукта.

Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта.

Поставленная цепь достигается спо" собом получения ксилозы, заключающимся в ферментативном гидролизе о водных растворов ксилана при 40 С в течение 4 ч путем обработки ксйланазой и -ксилозидазой и, в случае необходимости, ферментом, отщепляю" щим уроновую кислоту, которые.раздельно иммобилиэованы на неорганическом носителе, выбранном из группы: пористое стекло, силикагель или кизельгур. В результате ферментативно- .щ го гидролиза получают практически только ксилозу без примесей ксилобиозы. Выход 98,53.

Гидролиз ксилана с помощью фермента, связанного с носителем, отличается от гидролиза с помощью свободных ферментов тем, что благодаря более высокой стабильности связанных ферментов могут выбираться более высокие температуры, в результате чего 40 реакция идет быстрее.

Температуры в пределах 30-60 С, предпочтительно в пределах 40-45оС,. дают, как правило, оптимальные результаты. 45

Выход ксилозы в соответствии с предлагаемым способом заметно вы- ше, чем тогда, .когда с носителем производят одновременное связывание кси" ланаэы, -ксилозидазы и фермента, 50 вызывающего отщепление уроновой кислоты, и пытаются осуществить ферментный гидролиэ ксиланов за.счет того, что на водный раствор ксиланов воздействуют с помощью носителя, содержащего все эти три фермента.

В описании и s примерах, когда речь идет о процентах подразумеваются весовые проценты.

Пример 1. Процесс выделения (варки).

400 г древесины красного бука в форме рубленной щепы подвергают сушке на воздухе, обрабатывают на дефибраторе с помощью водяного пара при 185- 190 С в течение 6-7 мин и под соответствующим давлением в

12 атм приблизительно в течение 40 с.

Полученный таким образом сырой волокнистый материал вымывают из дефибратора, в результате чего получают 4 л пульпы, которая была загружена на сито.

Выход волокнистого материала сос. тавляет 834 из расчета на исходную древесину (абс. сух).

Промытый и отжатый на прессе волокнистый материал затем суспендируют при комнатной температуре в 5 л

14-ного раствора NaOH и 30 мин спустя отделяют от щелочной вытяжки путем Фильтрации и прессования.

После промывки водой, разбавленной кислотой и вновь водой, выход волонистого материала составляет 663 на исходную древесину (абс. cyx).

Соответствующим образом обработке подвергают и другие виды древесины, в том числе и в форме крупных опилок, а также в форме рубленной соломы.

В табл. 1 представлены средние значения выходов волокнистого материала (абс. cyx.).

ll р и м е р 2. Углеводородный состав после водной и щелочной. обработки.

Часть общего количества экстракта, полученного по примеру 1, продуктов водного и щелочного процессов подвергают полному гидролиэу (см. табл. 2).

Пример 3. Разделение и получение концентратов ксиланазы и jb-ксилозидаэы на основе ферментного препарата.

220 г ферментного препарата "Целлеэиме" {ксиланаза, ксилозидаза, энзим, отщепляющий 4-0-метилглюкуроновую кислоту). подвергают растворению в 4,8 л 0,02 М буферного раствора аммоний-ацетатного буфера при рН 5.

Нерастворяющийся остаток частично . удаляет путем пропускания через по ристый стеклянный фильтр. Затем раствор фермента фильтруют с осветлением через тефлоновый фильтр. Далее ультрафильтруют раствор фермента на приборе для ультрафильтрации TCF-10 фирмы Аминкон (Лексингтон, Массачузетс).i щепляющего кислоту).

25

3 10

Применяют следующие Аминкон-ульт-рафильтры (даны в порядке их использования). Область выделения мол. в.

ХМ100 А 100000

Х М 300 300000

Р М 30 30000

Э М 5 500

Очищенный раствор сырого фермента фильтруют первоначально через фильтр с областью выделения мол. в.

100000.

После этого кбйланаэа преимущественно находится в ультрафипьтрате. (Ь "Ксилозидаэа (неизвестный фермент, вызывающий отщепление 4-0-метил-глукуроновой кислоты от кислых ксилоолигомеров) находится преимуществеHHo в остатке.

Этот остаток ультрафильтрации профильтровывают через ультрафильтр, отделяющий мол. в. 300000. В конце названной операции Р-ксилозидаза вместе с активным ферментационным компонентом, вызывающим отщепление уроновой кислоты,. определяется только в светлом растворе ультрафильтрата, а густой темно-коричневый остаток не содержит активных компонентов

-ксилозидазы и уроновой кислоты.

Полученный при первой ультрафильтрации фильтрат подвергают далее следующей обработке.

Ультрафильтрация на P М 30: ксила-. наза после этого этапа снова в ультрафильтрате. Вещества, не обладающие активностью ксиланазы, выделяются в остаток

Ультрафильтрация íà D М 5: ксиланаза находится в остатке; на этом этапе ее концентрируют; Одновременно наибольшее количество углеводов (в исходном материале 3Я) выделяется ,в ультрафильтрат.

В табл. 3 приведены значения активности IlO ксиланаэе, Ъ-ксилозидазе

И ферменту, вызывающему отщепление уроновой кислоты, Представленные величины обозначены условными единицами. Одна условная единица. сооответствует такому количеству фермента, которое содержание сахара в разлагаемом растворе повышает при 370C на

1 мк моль ксилоэы для ксиланазы и ф-ксилозидазы и на 1 мк моль 4-0-метилглюкуроновой кислоты для фермента; отщепляющего кислоту (разлагаеьый раствор - 13 ксилана буковой древесины для ксиланазы, 2 ммоль.п-нитрофенилксилопиранозида для Jb-ксилози11050 ф дазы, 0,02 мкг/мкл 4-0-метилглюкуронозил-ксилотриозы для фермента, отДля измерения активности Р-ксилозидазы осуществляют взаимодействие разбавленного раствора и-нитрофенил" ксилоэида в объеме 1,5 мл с 2 мл

0,1 И боратного буфера рН 9,8.

Анализ высвободившегося п-нитрофенола проводят непосредственно в спектре 420 нм по его ослаблению.

Количество п-нитрофенола считывают по тарировочной кривой и пересчитывают на ксилозу.

В качестве субстрата, отщепляющего уроновую кислоту, служит 4-0-метилглюкуронозил-ксилотриоза.

ll р и м е р 4. Отложение фермен- та на носителе.

В качестве носителя фермента выбирают пористое стекло.

Ксилонолитические ферменты связываются с носителем через альдегид глютариновой кислоты.

1 г пористого стекла в течение ночи подогревают с обратным холодильником 103-ного раствора гамма-амино-пропил-триэтоксилана в толуоле. За счет этого носитель получает группу

З0,амина. После этого производят интенсивную промывку последовательно толуолом и ацетоном. Затем носитель интенсивно перемешИЬают с 20 мл

53-ного раствора альдегида глютариновой кислоты в 0,02 м фосфатном буфере при рН 6,5. Перваначально в те- чение 15 мин перемешивание производят под вакуумом, а затем дальнейшую инкубацию осуществляют при нор" мальном давлении. Далее проводят от40 сасывание, и материал носителя подвергают тщательной промывке 200 мл буферного раствбра.

На основе такого активированного материала носителя получают два фер-.

W5 ментных препарата, связанных с носи" телем: а) 1 r такого активированного носителя перемешивают в течение ночи с 5 мл ксилоназного ферментного раст50 вора с активностью 657 усл. ед., по" лученного в соответствии с примером 3.

Далее осуществляют промывку через пористый стеклянный фильтр с помощью раствора 1 И ИаС1 в -0,02 И фосфатном буфере с рН 4, после чего промывку осуществляют 0,02 M раство" ром фосфатного буфе 5а с рН 5 до тех

011050 4

30

5 1 йор, пока вода промывки не будет содержать фермента.

Полученный таким образом препарат.

1 содержит на 1 r 64 усл. ед. -свя" занной эффективной ксилоназы. б) Работу проводят как указано в пункте а, однако используют 5 мл раствора, полученного в соответствии с примером 3, который содержит

33 усл. ед. P -Kñèëîçèäàçû и

60 усл. ед. фермента, отщепляющего уроновую кислоту.

Полученный препарат 2 содержит в связанном состоянии на 1 г приблизительно 33 усл. ед. Р-ксилозидазы и

60 усл. ед. фермента, производящего отщепление уроновой кислоты.

П р.и м е р 5. Гидролиз ксилана древесины бука.

2 мл раствора ксилана, полученного no примеру 1 s результате промыв" ки водой древесины бука после ее варки (этот раствор содержит 1,33 ксилана), инкубируют с 60 мг препарата 1 л с 60 мг препарата 2, полученных как указ но в примере 4, причем во время инкубации в водяной. бане содержимое ее перемешивают встряхиванием, а температуру в ней поддержи вают равной 40 С.

Спустя 4 ч в результате гиуролиза ксилана буковой древесины образуются мономерные компоненты ксилозы и

4-0-метил-глюкуроновая кислота.

На фиг. 1.показана хроматограмма после 4 ч инкубирования. Из нее видно, что в растворе произошла полная деструкция ксилана до ксилозы.

Раствор не содержит ксилобиоэы.

Пример 6. В качестве носите" ля для фермента выбран силикагель (меркогель SI 1000). Работают точно так, как указано в примере 4, причем получают оба следующих ферментативных препарата, связанных с носите-. лем: а) 1 г активированного носителя, . содержащего. 59 ед. связанной ксиланазы.; б) 1 г активированного носителя, содержащего около 32 ед. -ксилоэида. зы и 59 ед. фермента в связанной форме, отщепляющего уроновую кислоту.

П р и м,е р 7. Работают как описано в примере 4, причем в качестве материала-носителя применяют кизельгур (инфузорная земля), При этом получают следующие .два ферментативных . препарата, связанных с носителем: а) 1 г активированного носителя содержит 52 ед. связанной ксиланазы; б) 1 г активированного носителя содержит 30 ед. -ксилоэидазы и

67 ед. связанного фермента, отщеп" ляющего уроновую кислоту.

Пример 8. Гидролиз ксилана букового дерева.

2 мл раствора ксилана, полученного согласно примеру 1 промывкой водой иэ переведенного в растворимую форму букового дерева (раствор содержит 1,33 ксилана), инкубируют

60 мг препарата 1 и 60 мг препарата

2, полученных согласно примеру 4, при 40 С на встряхиваемой водяной бане. Гидролиз ксилана производят аналитически хроматографией на колонке с применением ионообменной смолы.

Через 4 ч ксилан букового дерева гидролиэуют на его мономерные составные части и 4-0-метил-глюкуроновую кислоту.

На фиг. 2 приведена хроматограмма после четырехчасового инкубирования. Отсюда очевидно, что в растворе происходит полное расщепление кси- лана до ксилозы. Раствор не содержит ксилобиозы.

Сравнительный опыт. По 2 мл раст .воров ксилана, полученных согласно.примеру 1 (раствор содержит 13 мг ксилана в 1 мл), обрабатывают в те . чение 4 ч при 40 С тремя ниже описанными препаратами ферментов: а) 60 мг фермента (3,8 ед актив; ной ксиланазы соответственно относительной активности 9,7Ф), связанного с носителем, полученного соглас" но примеру 41 б) 60 мг препарата, связанного с носителем, полученного следующим образом: 1 г пористого стекла активи:руют, согласно примеру 4. 1 r активированного таким образом носителя перемешивают ночь с 5 мл неочищенного фермента, применяемого в приме" ре 3, затем промывают согласно примеру 4 а. Относительную активность полученного таким образом продукта не определяют, поскольку последующий опыт йоказал, что при помощи этого ферментативного препарата ксилан не может расщепляться до .ксилозы;

e) Смесь 60 мг препарата, получен. ного согласно примеру 4 а (3,8 ед. ксиланазы соответственно относитель ной активности 9,74) и 60 мг препа1011050

83

Бук

71

Тополь

86

Березка

Ель

Эвкалипт

71

Пшеничная солома

Солома ячменя

65

88

Солома овса

Таблиц а 2

Экстр матер

69

13

3 Бук

13 5

Н О

НЕОН l 3,2

6,8

ll

Н О

NaOH

Ель

77

Береза Н О

НаОН

11,2

7,3

8,3

6,5

76

6

Тополь Н О

NaOH

Эвкалипт Н О

NaOH

9>5

5,0

71

Пшени53

7,0

8,3

Н,О

Na0H

7 рата, полученного согласно примеру

4 б (2 ед.f?"ксилозидазы и 3,6 ед. фермента, отщепляющего уроновую кислоту, соответственно относительной активности 100t).

Расщепление ксиланов в трех раст- ворах контролируется через 3 ч хроматографией на колонке согласно примеру 5. Содержание ксилобиозы и ксиз лозы в растворах показано на фиг. 3. .Таблица1

1011050 10

Продолжение табл. 2

Р

Т абл и ц а

2568

34560

1541

1290

1996

7968

524 4480

1817

1011

21173

19730

Остаток

Экстрагирование материала

Ячмень H O

NaOH

Овес Н О

БвОН

Раствор Целлюзима

Остаток пос-. ле Х М 100 А

Ультрафильтрат Х М 100 А

Ультрафил ьтрат Х М 300

Ультрафильтрат Р М 30

6,1

9,5

5 1

4 4. 41

44 88

101 1 050

Составит@ а Л. Никулина, Техред И.Гергель К ректо Ю. Мак енко Редактор С» Пекарь илиал П Патент, r. Ужгород, ул.. роектная, аказ 51 Тираж 3 одписное

ВНИИЯИ Государственного .комитета СССР .. no делам изобретений и открытий

113035 Иосква W-35 Раушская наб. . 4/