Биочип для исследования клеток

 

Полезная модель относится к области медицины, но также может быть использована в ветеринарии и биологии. Биочип для исследования клеток содержит подложку (1), имеющую тестовые участки (2), содержащие иммобилизованные молекулы (3) веществ, способных связываться с поверхностными молекулами клеток. При этом в разных областях тестовых участков (2) плотность расположения иммобилизованных молекул (3) различается.

Полезная модель относится к области медицины, но также может быть использована в ветеринарии и биологии.

Известен биочип для исследования клеток (см. А.В.Шишкин, И.И.Шмырев, С.А.Кузнецова, Н.Г.Овчинина, А.А.Бутылин, Ф.И.Атауллаханов, А.И.Воробьев «Иммунологические биочипы для параллельного определения поверхностных антигенов и морфологического исследования клеток», Биологические мембраны, 2008, том 25, 4, с277-284), представляющий собой твердую подложку, на которой в тестовых участках (пятнах биочипа) иммобилизованы молекулы антител, каждое из которых специфично к определенному клеточному поверхностному антигену. Биочип позволяет определять антигены, находящиеся на поверхности исследуемых клеток, по связыванию клеток в тестовых участках.

Недостатком известного биочипа является невозможность оценки прочности связывания клеток в тестовых участках при выполнении отмывки с нерегулируемой (неизменяемой) скоростью потока жидкости. Кроме того, биочип содержит тестовые участки только с иммобилизованными молекулами антител. Использование других веществ, молекулы которых также могут связываться с поверхностными молекулами клеток, не предусмотрено.

Известен биочип для исследования клеток (см. А.В.Шишкин, И.И.Шмырев, С.А.Кузнецова, Н.Г.Овчинина, А.А.Бутылин, Ф.И.Атауллаханов, А.И.Воробьев «Иммунологические биочипы для исследования эритроцитов человека», «Биологические мембраны». - 2008. - 4 - С.267-276), взятый в качестве прототипа и представляющий собой твердую подложку, на которой в тестовых участках (пятнах биочипа) иммобилизованы антитела, каждое из которых специфично к определенному клеточному поверхностному антигену. При этом биочип содержит несколько тестовых участков с антителами каждого вида, различающихся плотностью расположения иммобилизованных молекул (количеством молекул, иммобилизованных на единице площади поверхности подложки). Это достигается нанесением на подложку капель растворов с различной концентрацией антител при изготовлении биочипа. Использование данного биочипа позволяет осуществлять оценку прочности связывания клеток в тестовых участках при выполнении отмывки с нерегулируемой (неизменяемой) скоростью потока жидкости. При исследовании клеток с помощью данного биочипа могут быть построены кривые титрования (зависимость плотности связывания клеток от разведения антител нанесенных, на подложку при изготовлении биочипа), позволяющие оценить прочность связывания клеток с биочипом.

Недостатком прототипа является необходимость нанесения на биочип большого числа тестовых участков с каждым антителом. Это повышает длительность и трудоемкость изготовления биочипа и требует использования подложек с большой площадью, что при проведении анализа требует повышенного расхода исследуемой клеточной суспензии. Кроме того, биочип содержит тестовые участки только с иммобилизованными молекулами антител. Использование других веществ, молекулы которых также могут связываться с поверхностными молекулами клеток, не предусмотрено.

Задачей заявленной полезной модели является уменьшение количества тестовых участков, необходимых для оценки прочности связывания клеток при выполнении отмывки биочипа с нерегулируемой (неизменяемой) скоростью потока жидкости.

Поставленная задача решается за счет того, что согласно полезной модели, на биочипе для исследования клеток, содержащем подложку, на которой расположены тестовые участки с иммобилизованными молекулами, способными связываться с поверхностными молекулами клеток, в различных областях тестовых участков плотность расположения иммобилизованных молекул неодинакова.

Плотность расположения иммобилизованных молекул в одном или нескольких тестовых участках образует непрерывный градиент.

Плотность расположения иммобилизованных молекул в одном или нескольких тестовых участках образует ступенчатый градиент.

В пределах тестовых участков имеется разметка, обозначающая места с наибольшей плотностью расположения иммобилизованных молекул, а также расстояние от них.

В пределах тестовых участков имеется разметка, обозначающая границы областей с разной плотностью расположения иммобилизованных молекул.

Биочип имеет один или несколько участков, указывающих на порядок считывания результата.

Подложка является прозрачной.

Подложка является светоотражающей

Биочип имеет один или несколько контрольных участков.

Использование заявленной полезной модели позволяет оценивать прочность связывания клеток с иммобилизованными молекулами (при выполнении отмывки биочипа с нерегулируемой (неизменяемой) скоростью потока жидкости), используя один тестовый участок для каждого из иммобилизованных веществ. При этом предусмотрена возможность использования не только антител, но и любых других веществ, молекулы которых способны связываться с молекулами, находящимися на поверхности исследуемых клеток. Наличие в пределах тестовых участков биочипа разметки, указывающей области с различной плотностью расположения иммобилизованных молекул, позволяет точно определять их границы при обработке результатов исследования. Наличие участка, указывающего порядок считывания результата, позволяет избежать возможных ошибок при считывании. Прозрачная подложка позволяет использовать микроскопию в проходящем свете при выполнении исследования клеток с помощью данного биочипа. Это также дает возможность определения плотности связывания клеток непрямым путем по величине светопропускания участков со связанными клетками. При выполнении подложки светоотражающей появляется возможность непрямого определения плотности заполнения тестовых участков связавшимися клетками путем определения яркости отражаемого света.

Описание полезной модели поясняется следующими фигурами, где

на фиг.1 представлен общий вид биочипа (сверху)

на фиг.2 представлен разрез А-А на фиг.1, схематически демонстрирующий молекулярную структуру тестового участка биочипа с непрерывным градиентом расположения иммобилизованных молекул.

на фиг.3 представлен разрез А-А на фиг.1, схематически демонстрирующий молекулярную структуру тестового участка биочипа со ступенчатым градиентом расположения иммобилизованных молекул.

Биочип содержит прозрачную или светоотражающую твердую подложку 1 (фиг.1), на поверхности которой имеются тестовые участки (пятна биочипа) 2 с иммобилизованными молекулами 3 (фиг.2, 3) антител или иных веществ (рецепторов, лигандов, молекул адгезии), способных связываться с поверхностными молекулами клеток. В разных тестовых участках 2 биочипа иммобилизованы молекулы 3 разных веществ, но в пределах отдельно взятого тестового участка 2 иммобилизованные молекулы 3 являются одинаковыми. Тестовые участки 2 (фиг.1) отделены друг от друга промежутками (фоновыми участками) 4. Фоновые участки 4 (фиг.2, 3) не содержат иммобилизованных молекул 3, способных связываться с поверхностными молекулами клеток. В фоновых участках 4, а также в тестовых участках 2 (между иммобилизованными молекулами 3) иммобилизованы молекулы 5 веществ, например альбуминов, блокирующих сайты неспецифического связывания и ослабляющих неспецифическое связывание клеток с материалом подложки 1.

Плотность расположения иммобилизованных молекул 3, в различных местах тестовых участков 2 неодинакова. При этом она, образует непрерывный градиент и постепенно уменьшается от центра тестового участка 2, к его периферии (фиг.2), либо образует ступенчатый градиент (фиг.3). В последнем случае тестовый участок 2 имеет область 6, где плотность расположения иммобилизованных молекул 3 является максимальной, а также ряд областей 7, 8, 9 с меньшей плотностью расположения иммобилизованных молекул 3. При этом в пределах одной и той же области плотность расположения иммобилизованных молекул 3 одинакова.

На обратной стороне подложки 1 (фиг.2, 3) в проекции тестовых участков 2 нанесена разметка 10. Применительно к одному тестовому участку 2 разметка 10 обозначает его центр и расстояние от него (фиг.2), либо обозначает границы областей 6, 7, 8, 9 с разной плотностью расположения иммобилизованных молекул 3 (фиг.3).

На подложке 1 биочипа также присутствует участок 11 (фиг.1), указывающий на порядок считывания результата. В этом участке на подложку 1 нанесена краска. Один из тестовых участков 2 является контрольным и содержит иммобилизованные молекулы 3 (фиг.2, 3) вещества, с которым могут связываться все типы клеток, присутствующих в исследуемом образце (положительный контроль). В качестве участков отрицательного контроля выступают фоновые участки 4. На подложке 1 биочипа имеется разметка 12 (фиг.1), облегчающая нахождение нужных тестовых участков 2 при неавтоматизированном считывании результата.

Исследование клеток с помощью биочипа осуществляют следующим образом. Биочип инкубируют с исследуемой клеточной суспензией. Затем его отмывают от клеток, не связавшихся с иммобилизованными молекулами 3. При этом связанные клетки остаются только в области некоторых тестовых участков 2 Отмывку выполняют под контролем микроскопии. Критерием качества отмывки биочипа является устранение клеток из фоновых участков 4. Затем осуществляют считывание результата. При этом в каждом тестовом участке 2 определяют размеры областей, заполненных связавшимися клетками. Чем больше прочность связывания клеток с иммобилизованными антителами, тем большие размеры имеют участки, в которых присутствуют связанные клетки.

Кроме того, определяют плотность связывания клеток (отношение количества связавшихся клеток к площади поверхности) в различных областях тестовых участков 2. При необходимости биочип фиксируют метанолом и обрабатывают красителем. Осуществляют морфологическое исследование и определяют качественный состав клеток, связанных в различных областях тестовых участков 2. При этом при необходимости устанавливают соотношение количества клеток различных типов (определяемых на основании морфологических признаков) связанных в данных областях.

1. Биочип для исследования клеток, содержащий подложку, на которой расположены тестовые участки с иммобилизованными молекулами, способными связываться с поверхностными молекулами клеток, отличающийся тем, что в различных областях тестовых участков плотность расположения иммобилизованных молекул неодинакова.

2. Биочип по п.1, отличающийся тем, что плотность расположения иммобилизованных молекул в одном или нескольких тестовых участках образует непрерывный градиент.

3. Биочип по п.1, отличающийся тем, что плотность расположения иммобилизованных молекул в одном или нескольких тестовых участках образует ступенчатый градиент.

4. Биочип по пп.1 и 2, отличающийся тем, что в пределах тестовых участков имеется разметка, обозначающая места с наибольшей плотностью расположения иммобилизованных молекул, а также расстояние от них.

5. Биочип по пп.1 и 3, отличающийся тем, что в пределах тестовых участков имеется разметка, обозначающая границы областей с разной плотностью расположения иммобилизованных молекул.

6. Биочип по п.1, отличающийся тем, что имеет один или несколько участков, указывающих на порядок считывания результата.

7. Биочип по п.1, отличающийся тем, что подложка является прозрачной.

8. Биочип по п.1, отличающийся тем, что подложка является светоотражающей.

9. Биочип по п.1, отличающийся тем, что имеет один или несколько контрольных участков.



 

Наверх