Аппарат для культивирования клеток и микроорганизмов

Авторы патента:

Изобретение относится к биотехнологии, а точнее к аппаратам для производства биомассы различных микробных культур и их метаболитов и может быть использовано в микробиологической, медицинской, пищевой промышленности и исследовательской практике.

Аппарат для культивирования клеток тканей и микроорганизмов включает ферментационную емкость 1 с крышкой 3 и патрубки соответственно для подачи аэрирующего газа 23 и отвода газовой среды 24 и отличается тем, что содержит вторую ферментационную емкость 2 с крышкой 4 и обе емкости снабжены матриксами 7, свободно размещенными в полости каждой емкости, а емкости сообщены между собой трубопроводом нижнего слива 9 и соединены трубопроводами с управляемыми клапанами 13 и 16 с патрубком для подачи аэрирующих газов 23, а также содержит насос 10, для ввода в первую ферментационную емкость питательных растворов и инокулюма посевной культуры, буферную емкость 11, соединенную трубопроводом с патрубком отвода газовой среды 24 и трубопроводами с встроенными управляемыми клапанами 14, 15 и 17 с ферментационными емкостями 1 и 2 и с шлюзовой камерой 12, соответственно, при этом шлюзовая камера 12 соединена трубопроводами с встроенными управляемыми клапанами 18, 20, 21 со второй ферментационной емкостью и с патрубками сбора получаемых продуктов 26 и слива 27.

Культивирование микробных, грибных или животных клеток представляет собой ключевые процессы, в которых используют живые клетки, так как они обеспечивают получение важнейших элементов, необходимых для экономически выгодного синтеза многих коммерчески ценных продуктов. В микробиологической практике для культивирования клеток применяют широко распространенные методы жидкофазной или твердофазной ферментации. При жидкофазной ферментации микроорганизмы культивируют в питательном растворе, а твердофазную ферментацию проводят на поверхности нерастворимого питательного субстрата. Жидкофазная ферментация, в отличие от твердофазной ферментации, процесс более совершенный, так как легко поддается автоматическому контролю и управлению. Однако, концентрация синтезированных продуктов в среде жидкофазной ферментации значительно ниже, чем в водных экстрактах твердофазной ферментации.

Известен способ и устройство культивирования клеточной культуры микрокапельки (патент США N 6,649,408, С12М 3/00, публ. 18.11. 2003). Описывается система, в которой ферментацию проводят на пористой поверхности гидрофобного материала, например, двуокиси кремния. При таком решении, образуются микрообъемы, которые располагаются внутри гидрофобных твердых частиц, что приводит к образованию большого количества малых реакторов для культивирования клеток.

Существенным недостатком такого культивирования является то, что образующиеся микрообъемы культуральной среды смешиваются со свежим питательным раствором только за счет диффузионного обмена, при этом часть клеток растет на поверхности кремниевого носителя, а клетки, не обеспеченные питательными веществами, погибают с образованием токсичных продуктов распада биомассы, негативно влияющих на качество целевых продуктов.

Известен «Аппарат для суспензионного культивирования клеток тканей и микроорганизмов» (RU 2270245 C1, C12M 1/04, С12М 3/00, публ 2006.02.20).

Аппарат содержит ферментационную емкость с крышкой и патрубками соответственно для подачи аэрирующего газа и отвода газообразной среды и устройство для аэрации и перемешивания культуральной среды, включающее контур аэрирующего газа и экран для образования газовой подушки, а также средство создания колебаний газовой подушки для перемешивания культуральной среды. Экран размещен в полости аппарата и при реализации ферментационных процессов погружен в культуральную среду.

Известно, что аэрация и перемешивание культуральной среды в ферментационных аппаратах являются одним из важнейших факторов, влияющих на производительность и качество синтезируемых продуктов. Примененное в аппарате устройство для аэрации и перемешивания культуральной среды работает по принципу сообщающихся сосудов. Перемешивание культуральной среды осуществляется за счет возвратно-поступательного перемещения жидкости из полости экрана в полость ферментационной емкости и обратно, а газообмен осуществляется через суммарную площадь поверхностного раздела среды газ - жидкость, которая образуется при подаче газов под экраны с последующим замещением газовых пузырей объемом свежего газа.

Заданные условия газо- и массообмена культуральной среды реализуются методом экстенсивного наращивания экранов, погруженных в культуральную среду, что приводит к уменьшению рабочего объема аппарата и, как следствие, к снижению его производительности.

Многослойное размещение экранов в полости ферментационной емкости способствует образованию застойных зон культуральной среды, что приводит к нарушению массообменных процессов и частичному автолизу клеток с образованием токсичных продуктов распада биомассы, что снижает производительность и качество целевых продуктов.

Множественные экраны, закрепленные в полости ферментационной емкости, требуют автономного управления газовыми потоками, что существенно усложняет эксплуатационное обслуживание аппарата.

К другим недостаткам известного аппарата можно отнести низкую производительность ферментационных процессов из-за невозможности использования твердых компонентов питательных сред, позволяющих повысить ферментативную активность клеток и синтез целевых продуктов.

Кроме того, конструкция аппарата не позволяет использовать в качестве продуцентов клетки с поверхностно зависимой формой роста, что снижает возможности применения аппарата. Это объясняется тем, что при культивировании поверхностно

зависимых клеток с использованием гранулированных микроносителей, произойдет слипание гранул за счет деления клеток и их соприкосновения в условиях недостаточного перемешивания. Агломерированная биомасса закупорит отверстия для протока культуральной среды, процесс выйдет из-под контроля, что приведет к снижению производительности и качества целевых продуктов.

Технический результат изобретения заключается в интенсификации ферментационных процессов, путем повышения эффективности массообмена в процессе культивирования клеток и микроорганизмов и расширении функциональных возможностей, обеспечением жидкофазного и твердофазного культивирования.

Указанный результат достигается тем, что аппарат для культивирования клеток тканей и микроорганизмов, включающий ферментационную емкость с крышкой и патрубки соответственно для подачи аэрирующего газа и отвода газовой среды, содержит вторую ферментационную емкость с крышкой и обе емкости снабжены матриксами, свободно размещенными в полости каждой емкости, а емкости сообщены между собой трубопроводом нижнего слива и соединены трубопроводами с управляемыми клапанами с патрубком для подачи аэрирующих газов, а также содержит насос для ввода в первую ферментационную емкость питательных растворов и инокулюма посевной культуры, буферную емкость, соединенную трубопроводом с патрубком отвода газовой среды и трубопроводами с встроенными управляемыми клапанами с ферментационными емкостями и с шлюзовой камерой, при этом шлюзовая камера соединена трубопроводами с встроенными управляемыми клапанами со второй ферментационной емкостью и с патрубками слива и сбора получаемых продуктов. А также тем, что корпус каждой емкости выполнен в виде отрезка трубы с теплообменной рубашкой и имеет горизонтальное рабочее положение. А также тем, что матрикс выполнен из сетчатого гофрированного полотна, свернутого в спираль.

А также тем, что гофрированное полотно матрикса может иметь пленочное напыление из питательных веществ или сорбентов.

А также тем, что матрикс включает нерастворимые компоненты питательной среды, размещенные в межвитковом пространстве спирали.

В зависимости от целевого использования аппарата, гофрированное полотно матриксов может иметь пленочное напыление из питательных веществ или включать нерастворимые компоненты питательной среды, размещенные в межвитковом пространстве спирали.

Интенсификация ферментационных процессов при использовании аппарата для культивирования клеток и микроорганизмов достигается за счет конструкции матриксов, позволяющих:

- в условиях ферментационного процесса создать пленку культуральной среды с пространственно развернутой поверхностью фазового контакта газ-жидкость, что обеспечивает высокую эффективность газообмена и, как следствие, производство качественных продуктов;

- повысить концентрацию питательной среды, за счет создания на сетчатом гофрированном полотне матрикса пленки из полисахаридов, что позволяет существенно повысить ферментативную активность клеток и, как следствие, повысить производительность ферментационных процессов;

- использовать межвитковое пространство матрикса для пространственно развернутой упаковки твердого субстрата или катализатора, что позволяет существенно расширить сферу применения аппарата.

Использование шлюзовой камеры для осуществления непрерывной работы аппарата и отбора проб позволяет существенно повысить асептическую надежность реализуемых процессов.

Другим существенным преимуществом изобретения является снижение эксплуатационных и энергетических затрат, достигнутых посредством применения исключительно простых конструкций ферментационных емкостей и системы управления процессами аэрации и перемешивания культуральной среды.

Изобретения поясняются чертежами, на которых:

на фиг.1 схематично изображен аппарат для культивирования клеток и микроорганизмов;

на фиг.2, 3 и 4 представлены матриксы в разрезе.

Аппарат для культивирования клеток и микроорганизмов, содержит ферментационные емкости 1 и 2, герметично закрываемые крышками, соответственно, 3 и 4, теплообменные рубашки 5 и 6, сменные матриксы 7, размещенные внутри ферментационных емкостей 1 и 2, трубопровод 9 нижнего слива, соединяющий ферментационные емкости, насос 10 для подачи питательного раствора и инокулюма в емкости 1 буферную емкость 11, шлюзовую камеру 12, управляемые клапаны 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, патрубки 22, 23, 24, 25, 26, 27 для подключения аппарата к внешним сетям и прибор управления 28.

Буферная емкость 11 через управляемые клапаны 14 и 15 сообщена с ферментационными емкостями 1 и 2 и через управляемый клапан 17 со шлюзовой

камерой 12, а также соединена трубопроводом с патрубком 24 для подключения к системе бактериальной очистки отработанных газов с последующим их отводом в атмосферу (на фиг.1 не показаны).

Ферментационные емкости 1 и 2 трубопроводами с управляемыми клапанами 13 и 16, соответственно, через патрубок 23, подачи аэрирующего газа, подключены к источнику сжатых стерильных газов (на фиг.1 не показан). Корпус каждой емкости выполнен в виде отрезка трубы с теплообменной рубашкой и имеет горизонтальное рабочее положение.

Шлюзовая камера 12 выполнена в виде емкости с управляемыми клапанами и сообщена: с ферментационной емкостью 2 через клапан 18, через клапан 19 и патрубок 25 с источником пара (на фиг.1 не показан), через клапан 21 и патрубок 27 с канализационным сливом и через клапан 20 и патрубок 26 со сборником произведенных продуктов (на фиг.1 не показан).

Управляемые концы клапанов 13-21 соединены с управляющей шиной прибора управления 28.

Сменные матриксы 7 выполнены из сетчатого гофрированного полотна, свернутого в спираль, и в собранном виде повторяют геометрию внутренней полости емкости.

В зависимости от условий культивирования может быть использован матрикс 7 (фиг.2), выполненный в виде сетчатого гофрированного полотна 29, свернутого в виде спирали с зазором 30 между витками, и размещенный в ферментационной емкости 1, или матрикса 7 (фиг.3), сетчатое полотно которого покрыто пленкой 31, например, агар-агара, или матрикс 7 (фиг.4), межвитковый зазор которого заполнен твердым субстратом, например, древесными опилками 32.

Перед началом работы аппарат подключают к внешним сетям посредством патрубков:

- патрубок 22 подключают к источникам питательного раствора и посевного инокулюма;

- патрубок 23 подключают к источнику сжатых стерильных газов;

- патрубок 24 подключают к системе бактериальной очистки отработанных газов с последующим их отводом в атмосферу;

- патрубок 25 подключают к источнику насыщенного водяного пара;

- патрубок 26 подключают к сборнику получаемых продуктов;

- патрубок 27 подключают к канализационному сливу.

Сменные матриксы 7 подготавливают к использованию исходя из специфических особенностей реализуемых процессов. Так, например:

- для выращивания клеточной биомассы, сетчатое гофрированное полотно 29 свертывают в спираль, оставляя межвитковый зазор 30 свободным (фиг.2);

- для реализации процессов биосинтеза ферментов, зазор 30 должен быть заполнен нерастворимым субстратом, например, древесными опилками (фиг.4);

- для производства вакцин, сетчатое гофрированное полотно покрывают пленкой 31 питательной среды, например, агар-агаром (фиг.3).

Работа аппарата для культивирования клеток и микроорганизмов осуществляется в следующей пооперационной последовательности.

Открывают крышки 3 и 4, емкостей 1 и 2 загружают ранее приготовленные матриксы 7, например, показанные на фиг.2, после чего крышки 3 и 4 герметично закрывают и проводят стерилизацию аппарата по известным методикам. После охлаждения аппарата, посредством протока термостатирующей жидкости через теплообменные рубашки 5 и 6, с помощью прибора 28 управления открывают клапан 14 и в ферментационную емкость 1, насосом 10, загружают заданные объемы жидкой питательной среды и инокулюма посевной культуры, после чего, клапан 14 закрывают. В исходном состоянии, полученная культуральная среда заполняет все свободное пространство в емкости 1 и межвитковом зазоре 30 матрикса 7.

На приборе 28 задают алгоритм работы аппарата, при исполнении которого открываются клапаны 13 и 15. Через клапан 13, в емкость 1 нагнетается аэрирующий газ, а культуральная среда, находящаяся в емкости 1, по трубопроводу 9, сливается в емкость 2 при одновременном вытеснении из емкости 2 воздуха через клапан 15, буферную емкость 11 и патрубок 24, в атмосферу. При вытеснении культуральной среды из емкости 1 в емкость 2, на сетчатом гофрированном полотне 29 матрикса 7, за счет сил поверхностного натяжения, образуется тонкая пленка культуральной среды, которая всей своей развернутой поверхностью контактирует с поступающим газом, обеспечивая высокую эффективность газообмена культуральной среды. По алгоритму, через заданное время, клапаны 13 и 15 закрываются и открываются клапаны 16 и 14. Аэрирующий газ через клапан 16 поступает в емкость 2 и вытесняет из нее культуральную среду по трубопроводу 9 обратно в емкость 1, а отработанный газ, находящийся в емкости 1, через клапан 14, буферную емкость 11 и патрубок 24 отводится в атмосферу. При вытеснении культуральной среды из емкости 2 в емкость 1, на сетчатом полотне матрикса 7, размещенного в емкости 2, за счет сил поверхностного натяжения, образуется тонкая пленка культуральной среды, которая всей своей развернутой поверхностью контактирует с поступающим газом, обеспечивая высокую эффективность газообмена культуральной среды.

При возвратно поступательном обмене культуральной среды между емкостями 1 и 2, образованные пленки культуральной среды на сетчатых гофрированных полотнах 29 матриксов 7 замещаются новыми, что позволяет обеспечить высокую эффективность обмена питательных веществ. Далее, указанный алгоритм повторяется заданное время до остановки процесса. Такой процесс характеризуется как периодический.

При использовании матриксов с пленочным покрытием из агаризованных сред или заполнении межвиткового пространства сетчатого полотна матриксов твердыми субстратами, ферментационные процессы будут периодически воспроизводить условия то жидкофазной, то твердофазной ферментации, что позволяет оптимизировать тепло-, газо- и массообменные процессы и, тем самым, обеспечить высокую ферментативную активность клеток и, как следствие, синтезировать целевые продукты высокого качества.

Непрерывная работа аппарата реализуется по следующему алгоритму:

На заданной стадии периодического процесса, насосом 10, в ферментационную емкость 1 периодически загружают заданный объем питательного раствора, который перемешивается с культуральной средой за счет ее перетекания из емкости 1 в емкость 2 и обратно. При увеличении рабочего объема культуральной среды выше номинального, избыточный объем вытесняется давлением отработанных газов из емкости 1, через открывшийся клапан 14 в буферную емкость 11, а отработанные газы отводятся через патрубок 24 в атмосферу. Одновременно с включением насоса 10, открываются клапаны 19 и 21, и осуществляется стерилизация шлюзовой камеры 12. При открытии указанных клапанов, насыщенный водяной пар протекает через патрубок 25, клапан 19, шлюзовую камеру 12, клапан 21, и отводится в канализационный сток через патрубок 27. Время стерилизации шлюзовой камеры 12 и температура пара задаются на приборе 28 управления. По завершении стерилизации, клапаны 21 и 19 закрываются, и шлюзовая камера 12 охлаждается в атмосфере окружающего воздуха. При охлаждении герметично закрытой камеры 12, давление пара в ней падает ниже атмосферного и камера 12 подготовлена к приему культуральной среды, насыщенной синтезированными продуктами. Перед загрузкой камеры 12, выдерживается временная пауза, при которой буферная емкость 11 загружается культуральной средой, вытесняемой из емкости 1 давлением отработанных газов. Во время паузы, открывается клапан 17, и культуральная среда из буферной емкости 11 перетекает в камеру 12. После заполнения камеры 12 культуральной средой, открывается клапан 20 и культуральная среда, под действием давления отработанных газов, через патрубок 26, сливается в сборник продуктов. Клапаны 20 и 17 закрываются и вновь открываются клапаны 19 и 21, обеспечивающие проток пара через камеру 12. В этот момент временная пауза, обеспечивающая загрузку

камеры 12 и слив культуральной среды в сборник продуктов, завершается и повторяется алгоритм перемещения культуральной среды из емкости 1 в емкость 2 и обратно. После пропаривания камеры 12, клапаны 21 и 19 закрываются, камера 12 охлаждается воздухом окружающей среды и готова к приему очередной порции слива культуральной среды.

При необходимости отбора проб в условиях периодического процесса, после проведения стерилизации шлюзовой камеры, открывается клапан 18, через который культуральная среда из емкости 2 перетечет в камеру 12. Клапан 18 закроется, откроются клапаны 17 и 20 и отобранный объем культуральной среды, находящийся в камере 12, будет вытеснен в пробоприемную емкость через патрубок 26. После отбора пробы, клапаны 20 и 17 закроются, и камера 12 будет вновь пропарена по вышеописанному алгоритму.

1. Аппарат для культивирования клеток тканей и микроорганизмов, включающий ферментационную емкость с крышкой и патрубки соответственно для подачи аэрирующего газа и отвода газовой среды, отличающийся тем, что аппарат содержит вторую ферментационную емкость с крышкой и обе емкости снабжены матриксами, свободно размещенными в полости каждой емкости, а емкости сообщены между собой трубопроводом нижнего слива и соединены трубопроводами с управляемыми клапанами с патрубком для подачи аэрирующих газов, а также содержит насос для ввода в первую ферментационную емкость питательных растворов и инокулюма посевной культуры, буферную емкость, соединенную трубопроводом с патрубком отвода газовой среды и трубопроводами с встроенными управляемыми клапанами с ферментационными емкостями и с шлюзовой камерой, при этом шлюзовая камера соединена трубопроводами с встроенными управляемыми клапанами со второй ферментационной емкостью и с патрубками слива и сбора получаемых продуктов.

2. Аппарат по п.1, отличающийся тем, что корпус каждой емкости выполнен в виде отрезка трубы с теплообменной рубашкой и имеет горизонтальное рабочее положение.

3. Аппарат по п.1, отличающийся тем, что матрикс выполнен из сетчатого гофрированного полотна, свернутого в спираль.

4. Аппарат по п.3, отличающийся тем, что гофрированное полотно матрикса может иметь пленочное напыление из питательных веществ или сорбентов.

5. Аппарат по п.3, отличающийся тем, что матрикс включает нерастворимые компоненты питательной среды, размещенные в межвитковом пространстве спирали.