Носитель для культивирования клеток

Полезная модель относится к культивированию живых и растительных клеток и может быть использована в медицине, фармакологии, вирусологии, клеточной биологии и др. отраслях науки и техники. Носитель для культивирования клеток выполнен из углерод содержащего материала, состоящего из частиц алмаза, полученных методом детонационного синтеза, связанных углеродным связующим, полученным методом термического разложения газообразных углеводородов при массовом соотношении углеродного связующего и алмаза в пределах 0,1-0,4, при этом пористость материала носителя составляет 40-60% об. 1 з.п. ф-лы.

Полезная модель относится к биотехнологии, а более конкретно к устройствам для культивирования животных и растительных клеток, получения клеточной биомассы, образцов тканей и производства биологически активных веществ для их использования в медицине, ветеринарии, фармакологии, вирусологии, клеточной биологии, животноводстве и растениеводстве.

Методы клеточной биологии находят все большее распространение в различных областях современных фундаментальных и прикладных исследований. Одним из наиболее используемых является метод культивирования клеток человека, животных и растений. В настоящее время можно культивировать клетки практически всех тканей и органов человека, животных и растений. Культивирование клеток становится основой современных наукоемких технологий в биотехнологии и медицине, например, в биотехнологии - получение биологически активных веществ растительного и животного происхождения, вакцин, диагностикумов; в медицине - заместительная клеточная терапия, позволяющая восстанавливать поврежденные ткани путем трансплантации нормальных здоровых клеток человека, выращенных in vitro, производство моноклональных антител из гибридомных клеток.

Выращивание фрагментов органов и тканей с определенными свойствами для нужд медицины, получение клеточной биомассы для производства биомедицинской продукции, накопление каллусной ткани для микроклонального размножения растений является сложным процессом, требующим обеспечения и поддержания в течение длительного времени условий, необходимых для роста клеток. Одной из важных задач является правильный выбор носителя (субстрата). Клетки, размещенные на носителе, живут в организме значительно дольше, чем клетки, просто введенные в ткань, эффективность трансплантации при этом возрастает. Для создания носителей используют разные материалы: графит, полимеры, керамику, металлы и их сплавы, в частности, пористый никелид титана, нержавеющую сталь, кобальт-хромовые сплавы. При всех своих достоинствах, эти материалы могут вызывать сильное воспаление и некроз клеток, ионы никеля обладают канцерогенной активностью, а ионы хрома проникают в клетки и повреждают ДНК. Кроме того, к субстрату предъявляются комплексные требования по биосовместимости, способности выдерживать внешние воздействия, связанные со стерилизацией, температурными и влажностными условиями в которых происходит рост клеток, а также воздействию различного рода облучений (рентгеновского, ультрафиолетового и др.), которые используются в экспериментальных и технологических работах. Поэтому задача создания эффективных носителей для роста клеток является на сегодняшний день весьма актуальной.

Известен носитель для роста клеток, описанный в патенте США 7358029 (2008 г., кл. C12N 5/00), который выполнен из комбинации гидрофобных и гидрофильных полимерных смол, т.е. органических полимеров на основе углерода. В качестве таких смол могут быть использованы полиакриламиды, в том числе модифицированные ультрафиолетовым облучением.

Недостатками известного способа является недостаточно высокая биосовместимость используемых смол: как известно, все полимеры претерпевают процессы деструкции с выделением низкомолекулярных продуктов, воздействующих на рост клеточных структур, что не обеспечивает адекватность получаемых биологических материалов, особенно в условиях, сопряженных с внешними воздействиями при росте клеток. Кроме того, относительно невысокая температурная стабильность и низкая прочность полимеров создают сложности при их использовании в качестве носителя, т.к. требуют поддержания жестко контролируемых условий при стерилизации и условий роста клеток для недопущения деструкции полимера.

Задачей полезной модели является создание носителя, обладающего хорошей биосовместимостью в сочетании с высокой термической стабильностью и устойчивостью к воздействию внешних факторов.

Поставленная задача решается тем, что носитель для культивирования клеток выполнен из материала, состоящего из частиц алмаза детонационного синтеза, связанных углеродным связующим, полученным термическим разложением газообразных углеводородов. Массовое соотношение углеродного связующего и алмаза детонационного синтеза составляет 0,1-0,4.

Носители с массовым соотношением углеродного связующего и алмаза детонационного синтеза менее 0,1 не обладают достаточной прочностью, получение носителей с массовым соотношением углеродного связующего и алмаза детонационного синтеза более 0,4 технологически сложно.

Является предпочтительным наличие в носителе пористости 40-60% об., которая обеспечивает возможность передачи через пористую структуру питательной среды, необходимой для культивирования клеток.

Сущность полезной модели состоит в следующем. Носитель, предлагаемый в данном техническом решении, полностью состоит из углерода, а именно - из углерода двух кристаллохимических форм - алмаза детонационного синтеза и графитоподобной углеродной связки. Высокая биосовместимость углерода определяет высокую биосовместимость носителя, что позволяет культивировать на нем различные типы клеток. Высокая химическая инертность - абсолютная устойчивость углеродного носителя в кислотах, щелочах, органических средах - позволяет клеткам формировать трехмерные тканеподобные структуры, гарантируя отсутствие воздействия на рост клеток каких-либо химических компонентов, выделяющихся на поверхности субстрата под воздействием внешних факторов или продуктов метаболизма клеток. Сам носитель имеет гетерогенную структуру, которая сформирована частицами алмаза детонационного синтеза и углеродной связкой, связывающей частицы алмаза в единый композит. Порошки алмаза детонационного синтеза получают взрывом взрывчатых веществ. Они имеют размер частиц 4-5 нм. Массовое соотношение углеродного связующего и алмаза детонационного синтеза составляет 0,1-0,4.

Гетерогенная структура материала обеспечивает хорошую адгезию растущих клеток на поверхности материала. Это связано с возможностью клеток к локализации на поверхности тех или иных фрагментов структуры, а также на границе раздела углеродных фаз. Пористость носителя может быть использована для подачи растущим клеткам необходимой питательной среды.

Следующий пример характеризует сущность предлагаемой полезной модели:

Носитель для культивирования клеток состоит из частиц детонационного алмаза (объемное содержание 20% об.) и углеродного связующего. Массовое соотношение углеродного связующего и алмаза детонационного синтеза составляет 0,26. Пористость носителя - 58% об. Носитель получен путем формования заготовки в виде диска диаметром 20 мм и толщиной 1 мм из порошка детонационного алмаза и последующего формирования в заготовки углеродного связующего. Формирование связующего проводят из газообразных углеводородов - метана - при температуре 700°С до обеспечения указанного массового соотношения фаз.

Носитель использовали для культивирования человеческих фибробластов. Образцы стерилизовали автоклавированием при 121°С в течение 20 мин и помещали в полистироловые чашки Петри диаметром 35 мм ("Nunc", Дания). В чашки вносили суспензию фибробластов с концентрацией 105 кл/мл в среде DMEM ("Gibco", Англия) с 10% сыворотки плода коровы ("Gibco", Англия), 50 мкг/мл гентамицина и инкубировали в СO₂-инкубаторе с содержанием СO ₂ 5% в течение 5 суток до формирования конфлуентного монослоя в контроле.

По окончании инкубации из чашек удаляли питательную среду, клетки отмывали 0,15 М NaCl и фиксировали 2,5% раствором глутарового альдегида в течение 10 мин при температуре +4°С. После фиксации клетки трижды отмывали дистиллированной водой и в течение 10 мин инкубировали в растворе бромистого этидия. Клетки изучали в ультрафиолете с помощью люминесцентного микроскопа Leica DM 1000.

Было показано, что фибробласты равномерно распределяются по всей поверхности, легко прикрепляются к субстрату и, проникая в микропоры, образуют трехмерные структуры. Фибробласты сохраняли жизнеспособность на протяжении всего периода культивирования.

Таким образом, применение предлагаемого технического решения обеспечивает возможность эффективного культивирования клеток различного типа, использовать носитель для формирования тканеподобных трехмерных клеточных структур.

1. Носитель для культивирования клеток, состоящий из углеродсодержащего материала, отличающийся тем, что носитель выполнен из материала, состоящего из частиц алмаза детонационного синтеза, связанных углеродным связующим, полученным термическим разложением газообразных углеводородов, при этом массовое соотношение углеродного связующего и алмаза детонационного синтеза составляет 0,1-0,4.

2. Носитель по п.1, отличающийся тем, что его пористость составляет 40-60 об%.