Установка для инактивации микроорганизмов
Полезная модель относится к микробиологической и медицинской промышленности и может найти применение в биологии, медицине при разработке новых профилактических препаратов и вакцин против особо опасных инфекций. Задачей настоящего решения является разработка установки для инактивации микроорганизмов, обладающей расширенными функциональными возможностями. Технический результат заключается в оптимизации режимов инактивации, позволяющих воздействовать на бактериальные взвеси светом с любыми заданными параметрами и в любом временном режиме. Поставленная задача решается тем, что установка для инактивации микроорганизмов, содержащая емкость для микроорганизмов и источник для их облучения, согласно решению, емкость представляет собой планшет для иммуноферментного анализа с лунками, а источник для облучения выполнен в виде матрицы источников света - фотодиодов, подключенных к регулируемому источнику питания, при этом каждый из фотодиодов соединен с соответствующей лункой планшета.
Полезная модель относится к микробиологической и медицинской промышленности и может найти применение в биологии, медицине при разработке новых профилактических препаратов и вакцин против особо опасных инфекций.
Известна установка для инактивации микробиологических вакцин, содержащая емкость для приготовления суспензии микроорганизмов с мешалкой, установленной на вертикальном приводном валу, сообщенную с дополнительной емкостью, служащей для смешивания суспензии с инактивирующей жидкостью и имеющей патрубок для отвода этой жидкости, теплообменник для термической обработки суспензии и трубчатые бактерицидные лампы для ультрафиолетового облучения микроорганизмов (см. авторское свидетельство №1714926, МПК С12М 1/00).
Однако данное устройство может быть использовано только для стерилизации вакцин при их промышленном изготовлении и не может быть использовано для поиска режимов фотоинактивации, гарантирующее девитализацию 100% бактериальных клеток, при сохранении структуры поверхностного антигена.
Наиболее близкой к предлагаемому является установка для инактивации микроорганизмов, включающая сборник суспензии микроорганизмов, подлежащих инактивации, сборник инактивирующей жидкости, смеситель, подключенный при помощи патрубков к сборникам, емкость для ультрафиолетового облучения смеси с днищем и крышкой, снабженную подводящим и отводящим патрубками и размещенными внутри нее бактерицидными лампами, и сборник инактивированной суспензии (см. авторское свидетельство №1593216, МПК С12М 1/12, A61L 2/10).
Однако данное устройство не обеспечивает режимов щадящей инактивции бактерий и не может быть использовано для обеспечения режимов инактивации клеток-возбудителей особо опасных инфекций с сохранением структуры поверхностного антигена для их дальнейшего применения в качестве профилактических препаратов. Данное устройство позволяет лишь инавктивировать значительное количество клеток, не гарантируя при этом инактивации 100% бактерий. Последнее обстоятельство является исключительно важным, поскольку, например, такое особо опасное заболевание как туляремия развивается при попадании в организм человека или животного единичных жизнеспособных клеток.
Задачей настоящего решения является разработка установки для инактивации микроорганизмов, обладающей расширенными функциональными возможностями.
Технический результат заключается в оптимизации режимов инактивации, позволяющих воздействовать на бактериальные взвеси светом с любыми заданными параметрами и в любом временном режиме.
Поставленная задача решается тем, что установка для инактивации микроорганизмов, содержащая емкость для микроорганизмов и источник для их облучения, согласно решению, емкость представляет собой планшет для иммуноферментного анализа с лунками, а источник для облучения выполнен в виде матрицы источников света - фотодиодов, подключенных к регулируемому источнику питания, при этом каждый из фотодиодов соединен с соответствующей лункой планшета.
Полезная модель поясняется чертежами, на фиг.1 приведена блок-схема установки для фотоинактивации бактериальных взвесей, на фиг.2 - общий вид макета установки для фотоинактивации, на фиг.3 - показано облучение клеток в стерильных условиях ламинарного бокса, а на фиг.4 - облучение клеток в термостате в процессе их роста при фиксированной температуре, где
1 - планшет для иммуноферментного анализа;
2 - матрица из источников света (излучения);
3 - источник питания.
Установка для инактивации микроорганизмов содержит планшет 1 для иммуноферментного анализа, соединенный матрицей 2 из источников света с регулируемым источником питания 3. Каждая лунка планшета снабжена индивидуальным источником - фотодиодом.
Длина волны излучаемого света составляет 650 нм. Мощность излучения каждого источника можно варьировать в диапазоне 0,2 мВт до 1 мВт. При необходимости фотодиоды могут быть заменены лазерами разной мощности и с необходимой длиной волны излучаемого света. Данная установка позволяет воздействовать на бактериальные взвеси светом с любыми заданными параметрами и в любом временном режиме.
Установка работает следующим образом.
После включения источника питания 3, матрица из источников света 2 начинает облучение бактериальных клеток в каждой лунке планшета 1. Оптическое излучение вызывает возбуждение молекул фотосенсибилизатора, находящегося в водном растворе. В свою очередь, возбужденные молекулы взаимодействуют с молекулами кислорода, растворенного в водной фракции физиологического раствора, содержащего бактериальные клетки (фотодинамическая реакция типа II по классификации Шенка). В
результате образуются молекулы синглетного кислорода O2-, который представляет собой чрезвычайно агрессивный восстановитель.
Попадание молекулы синглетного кислорода в клеточную мембрану инициирует первичные изменения мембраны. Эти изменения описываются некоторой величиной m*, характеризующей степень поражения клетки-мишени. Состояние клетки выражается некоторой относительной величиной
где mо - величина, характеризующая начальное состояние клетки (до облучения). Очевидно, что М=1 при отсутствии изменений в клетке, М=0 в случае поражения мембраны, ведущего к полной утрате жизнеспособности клетки.
В процессе облучения в клетке запускаются также восстановительные процессы за счет действия антиоксидантной системы. Эти процессы компенсируют изменения, произошедшие в клетке в результате фотодинамического воздействия. Восстановительные способности клетки тем больше, чем меньше изменения в клеточной мембране в результате перекисного окисления липидов, инициированных действием свободного радикала О2-.
Иными словами, восстановительные процессы в клетке описываются соотношением:
где 
- скорость восстановления клетки; >0.
Величина структурных изменений клетки пропорциональна количеству молекул синглетного кислорода, попадающих в клеточную мембрану, и тем больше, чем меньше степень ее поражения М. В свою очередь, количество образующихся молекул синглетного кислорода пропорционально концентрации фотосенсибилизатора С и интенсивности света I(t), облучающего раствор. Таким образом,
где 
(положительная константа) - скорость поражения клетки за счет фотодинамического воздействия, W(t)=S·I(t) - мгновенная мощность излучения, равная произведению мгновенной интенсивности I(t) на площадь S облучаемой взвеси. Тогда,
окончательно, уравнение, описывающее динамические изменения в бактериальной клетке, выражается уравнением:
W(t) является случайным статистическим процессом, описывающим когерентные свойства динамического спекл-поля. Для случая динамических лазерных спеклов W(t) подчиняется экспоненциальному статистическому распределению. При этом контраст спеклов равен 0.7, если для облучения используются деполяризованные спекл-поля (рассматриваемые как тепловое излучение, продуцируемое низкокогерентными источниками света).
На основе данных экспериментальных исследований была проведена идентификация параметров предложенной математической модели. В случае облучения бактериальной взвеси светом с постоянной интенсивностью (т.е. когда полностью когерентное поле освещает неподвижные клетки, W=W0=const) решение последнего уравнения имеет вид:
Однако, с учетом того, что отклик клетки на мгновенное изменение интенсивности может быть существенно нелинейным, решение целесообразно искать в виде:
где N - заданное число членов в разложении (6).
Для идентификации параметров модели была проведена серия из 72 опытов с использованием живых бактерий вакцинного штамма возбудителя туляремии. При облучении бактериальной взвеси каждый из параметров варьировался в широких пределах (а именно: средняя мощность W 0
[0.2;1] мВт, концентрация фотосенсибилизатора С[0.0005; 0.05]%, время облучения изменялось от 3 минут до 3 часов 30 минут). С использованием методов регрессионного анализа и методов нелинейной оптимизации были определены первые 5 коэффициентов {
n} в представлении (6) (иными словами, число N в разложении (6) полагалось равным 5). Ошибка интерпретации данных при этом не превышала 20%.
С использованием предложенной модели было проведено моделирование процессов облучения бактериальных клеток динамическим спекл-полем и произведена оптимизация режима облучения. Установлено, что в оптимальном режиме облучения (мощность излучения 0.2 мВт, концентрация метиленового синего в растворе С=0.005%) гарантированная инактивация 100% туляремийных бактерий взвеси происходит на 6 минуте облучения. Как показывают проведенные эксперименты, морфологические изменения и токсический эффект после введения группе животных (белым мышам) препаратов, изготовленных на основе клеток, прошедших лазерную инактивацию, обнаружен не был.
Облучаемый материал в дальнейшем предполагается использовать для иммунизации животных, очень важно, что данная установка позволяет проводить работы со стерильным материалом. Бактериальная взвесь требуемой концентрации клеток готовится стерильно и разливается стерильными пипетками в стерильные лунки планшета со съемными стрипами. Для защиты образцов от контаминации посторонней микрофлорой планшет сверху накрывается стерильной крышкой. Планшет со взвесью помещается над планшетом с фотодиодами таким образом, чтобы каждый образец находился строго над индивидуальным источником света. Если в процессе облучения одной и той же взвеси требуется получить образцы с различным временем воздействия света, то для этого требуется только сдвинуть (не снимая!) крышку и взять необходимый стрип. Остальные образцы будут продолжать облучаться в стерильных условиях.
Бактериальная взвесь может быть размещена в 96 лунках планшета, объем каждой из которых составляет 0,35 мл. Таким образом, общий объем бактериальной взвеси, полученный за один сеанс облучения, составляет 33,6 мл. Этого объема достаточно, чтобы провести иммунизацию 112 белых мышей или 67 морских свинок или 67 белых крыс. Кроме того, этого количества материала вполне достаточно для проведения различного рода биохимических, генетических, микроскопических и других исследований.
Небольшой размер установки позволяет поставить ее, например, в стерильном ламинарном боксе (фиг.3) или в термостате с фиксированной температурой (фиг.4), если исследования требуют обеспечения режима облучения бактерий в процессе их роста.
Малые габариты установки особенно важны в тех случаях, когда эксперименты проводятся на облигатных анаэробах. Производить такие работы в обычных условиях невозможно, поскольку кислород для этих бактерий является ядом. Поэтому для
культивирования анаэробов применяют особые камеры анаэростаты, функция которых сводится к удалению кислорода из среды обитания микроорганизмов. Размеры анаэростатов, как правило, малы из-за того, что технически достаточно сложно создавать и поддерживать анаэробные условия в большом объеме длительное время.
Преимуществом предложенной установки является то, что в анаэростат можно помещать только занимающие малый объем планшеты с источником света и с бактериальной взвесью, а все остальные составные части установки могут оставаться вне камеры.
Таким образом, можно сказать, что сконструирована и собрана установка для фотоинактивации бактериальной взвеси, которая имеет целый ряд несомненных преимуществ. Во-первых, данная установка за один сеанс облучения позволяет получать препаративное количество бактериального материала. Во-вторых, при необходимости все микробиологические манипуляции могут проводиться стерильно. В-третьих, установка позволяет варьировать различные параметры облучения: время, мощность, длину волны, что дает возможность проводить исследования зависимости степени инактивации клетки от длительности облучения, дозы облучения, плотности мощности излучения, концентрации фотосенсибилизатора, концентрации бактериальных клеток и т.д. И, наконец, в-четвертых, компактные размеры установки дают возможность проводить облучение бактериальных клеток в стерильных условиях ламинарного бокса, анаэростате, в термостатах с фиксированной температурой и других приборах с ограниченным объемом.
Установка для инактивации микроорганизмов, содержащая емкость для микроорганизмов и источник для их облучения, отличающаяся тем, что емкость представляет собой планшет для иммуноферментного анализа с лунками, а источник для облучения выполнен в виде матрицы источников света - фотодиодов, подключенных к регулируемому источнику питания, при этом каждый из фотодиодов соединен с соответствующей лункой планшета.
