Тест-система для полуколичественного иммуноферментного определения аллергенспецифических ige-антител в сыворотке крови человека (ige-at-ифа)

 

Полезная модель относится к медицине, а именно, к лабораторной диагностике. Поставленная задача осуществляется посредством предлагаемой тест-системы IgE-AT-ИФА. Полезная модель представляет собой комплект, в состав которого входят набор реагентов, включающий твердофазный носитель с иммобилизованными отечественными аллергенами широкого спектра, калибра-торы, готовые к применению и с известным содержанием IgE-антител, промывочный раствор, конъюгат, субстрат-хромогенная смесь, готовая к употреблению, стоп-реагент и инструкцию по применению, упакованные в одной коробке.

Полезная модель относится к медицине, а именно, к лабораторной диагностике.

К заболеваниям, вызванным недостаточностью иммунной системы, по данным ВОЗ, относятся и аллергические заболевания, число которых с каждым годом асе увеличивается Основными причинами значительного роста таких патологий во всем мире являются индустриализация, химизация, загрязнение окружающей среды. Распространенность таких заболеваний имеет более высокие значения в регионах (районах) с экологически неблагоприятной обстановкой, обусловленной антропогенными воздействиями на окружающую среду, и зависит как от характера аплергениого окружения, так и от климатогеографических особенностей (Пищевая аллергия у детей. Современные аспекты. - Ревякина В.А., Боровик Т.Э., Российский Аллергологический Журнал. N2, 2004.)

Следовательно, проблема аллергических заболеваний является важной медико-социальной проблемой современности, значение которой будет возрастать в последующие годы. Пути решения указанных проблем нашли свое отражение в Приказе Минздравсоцразвития России №342 от 16 мая 2005 г. где в приложении №1 «ПОЛОЖЕНИЕ ОБ ОРГАНИЗАЦИИ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ВРАЧА АЛЛЕРГОЛОГА-ИММУНОЛОГА» в разделе «Диагностика» обязательным пунктом вошло определение специфических IgE-антител к различным видам аллергенов.

Таким образом, определение уровня специфических антител класса IgE в диагностике аллергических заболеваний представляется важным критерием в комплексе диагностическкх мероприятий. А значит, решение практических медицинских вопросов этой проблемы в значительной степени зависит от качества специфической аллергодиагностики in vitro.

Среди лабораторных методов в специфической диагностике аллергий наиболее информативными являются иммунологические: радиоаллергосорбентный тест (PACT) и метод иммуноферментного анализа (ИФА), выявляющие с большой достоверностью специфические IgE и IgG-антитела к различным пищевым аллергенам. Диагностическая ценность данных методов очень высока и составляет 87-85%, информативность же кожного тестирования пищевыми аллергенами - лишь 49%. (Аллергические болезни. Диагностика и лечение. Под ред. Р.Паттерсона. М., Гэотар Мед., 2000, с.733.). Более приемлема для клинического использования, по мнению исследователей, полуколичественная оценка (Комарова М.В. Синельникова Л.В. Фуфыгина Е.Г. К вопросу об исследовании пищевой непереносимости по немедленному и замедленному механизмам. - Сборник научных трудов: "Екатеринбургский консультативно-диагностический центр: итоги 15-летней деятельности в практическом здравоохранении", - Екатеринбург, 2004. - С.229-230).

На Российском рынке определение уровня специфических IgE-антител широко представлено тест-системами зарубежных компаний. Из отечественных производителей тест-системы по определению специфических IgE-антител к различным видам аллергенов выпускают в ФГУП «Аллерген». г.Ставрополь.

Компания "Хитачи Кемикл Диагностике Инк." США) предлагает хемилюминесцентный метод определения специфических IgE и IgG - множественный аллергосорбентный тест с применением хемилюминесцентного анализа (MAST-CLA). Сущность метода MAST-CLA заключается в проведении реакции аллергенспецифический IgE (IgG) с последующей меткой образовавшегося комплекса фотореагентом и определении его свечения, интенсивность которого пропорциональна концентрации специфического IgE (IgG) в сыворотке пациента.

Компания Dade Behring (США) предлагает измерение специфических иммуноглобулинов крови на основе нефелометрического метода. Метод основан на реакции преципитации комплекса «белок - высоко специфичная сыворотка». Для этого производятся измерения бокового рассеяния лазерного излучения на длине волны 480 им. с использованием автоматического анализатора.

Голландская фирма "Medland Systems" предлагает определение специфических IgЕ и IgG в сыворотке крови с использованием алектредиагностического хемилюминисцентного аппарата CLA-1.

Предлагаемые для специфической диагностики аллергены иммобилизованы на твердофазном носителе, в роли которого выступает нитроцелотктозный диск (аллергодиск) диаметра лунки микропланшета (при определении специфических IgE-антител) либо поверхность пластиковых пробирок или лунок микропланшета (при определении специфических IgG-антител).

Milenia-Biotec, Германия, предлагает тест-системы, в которых диагностируемые аллергены представлены в виде тест-кассет.

Наиболее близкой по техническому решению является тест-система для определения специфических IgE-антител к различным аллергенам ФГУП «Аллерген», г. Ставрополь.

Принцип метода: аллергены иммобилизованы на твердофазном носителе (полистироловые 96-луночные планшеты наборные или сплошные). Калибраторы предварительно разводят титрованием. Сыворотку крови и разведенные калибраторы по 100 мкл вносят в лунки планшета. Аллергены связываются со специфическими антителами, присутствующими в сыворотке крови пациента. Избыток антител удаляется на стадии промывки. На следующем этапе ферментмеченые антитела связываются с аллерген-антительным комплексом. После промывки и удаления несвязавшихся компонентов добавляется субстратный раствор, состоящий из ортофенилендиамина и цитратного буферного раствора, взаимодействующий с ферментом, в результате образуется цветной комплекс. Оптическая плотность полученного раствора прямо пропорциональна концентрации специфических IgE-антител в образце сыворотки.

Однако, указанная тест-система для определения специфических иммуноглобулинов класса Е, имеет рад существенных недостатков:

- дополнительные затраты времени и реактивов на предварительное разведение и титрование калибраторов;

- использование большого (100 мкл) сыворотки пациента на 1 аллерген, что затрудняет диагностику широкого спектра аллергенов у одного пациента;

- использование ортофенилендиамина, ядовитого веицества, в качестве хромогена;

- большие затраты субстратной смеси.

Вышеперечисленное затрудняет широкое использование тест-системы в практическом здравоохранении.

Поставлена задача разработки тест-системы для полуколичественного иммунофермеитного определения специфических IgE-антител к широкому спектру отечественных аллергенов в сыворотке крови пациентов (IgE-AT-ИФА).

Поставленная задача осуществляется посредством предлагаемой тест-системы IgE-AT-ИФА, в состав которой входят следующие реагенты, упакованные в одной коробке:

Референс-реагент 1 (Р1) - 96-луночные наборные стрипированнные планшеты размером 125×85, из прозрачного полимерного материала (кат ЛЬ №95029100 Thermo Labsystems, кат. №70507 Greiner) с горизонтальными и вертикальными рядами лунок (8×12). используемые в качестве твердофазного носителя, на которых иммобилизуются моноклональные анти-IgЕ-антитела. Предлагаемые наборные планшеты обладают высоким качеством сорбции, оптическая плотность каждой лунки планшета стандартизирована и не превышает 0,04 единиц оптической плотности (ОП). В лунках вертикального ряда №1 находятся иммобилизованные моноклональные антитела (МКАТ) анти IgE, а в лунках вертикальных рядов с №2 по №12 находятся иммобилизованные аллергены, очищенные, стандартизованные по содержанию азота белка (ОАО "Биомед" им. И.И.Мечникова).

Референс-реагент 2 (Р2) - калибровочные пробы: КПА, КПВ, КПС, КПО, А КПО -содержащие известное количество IgE и соответствующие по ОП - 4, 3, 2, 1, 0 классам (калибрование по стандарту WHO 67/87), жидкие, готовые к применению.

Реагент 3 (Р3) - полистироловые наборные стрипы фирмы "Thermo Lab-systems" (Финляндия) или фирмы "Greiner" (Германия) покрытые различными аллергенами с концентрацией 40 мкг/мл путем физической сорбции - 22 стрила (ряда) по 11 стрипов (рядов) разной специфичности в каждом планшете. Использование наборных стрипов указанных фирм позволяет использовать единичные лунки, что дает возможность избежать периода накопления необходимого для цельных или стриповых 96-луночных планшет сывороток пациентов и сократить время постановки диагноза.

Реагент 4 (Р4) - конъюгат (антитела моноклональные диагностические против легких и тяжелых полипептидных цепей иммуноглобулинов Е человека с

ферментом пероксидазой из хрена. Рабочее разведение конъюгата 1:100 (изготовлен в Санкт-Петербурге ФСП №42-0190-0593-00 от 16.01.2002 г.). Использование указанного конъюгата позволяет улавливать только специфические IgE-антитела.

Реагент 5 (Р5) - промывающий раствор, концентрированный, рН 7,4. Компоненты трио-буфера подобраны с учетом отсутствия перекрестных реакций с другими реагентами тест-системы, что исключает регистрацию неспецифических реакций

Реагент 6 (Р6) -- субстрат-хромогенная смесь [ перекись водорода (ГОСТ 177-88), 3 мМ, в 31 мМ цитратном (кислота лимонная ТУ 6-09-584-75) буфере: тетраметилбензидин - ТМБ (ЗАО "Диаплюс", кат. №0763600)], Система ТМБ-субстрат обеспечивает примерно в 10 раз более высокую чувствительность выявления пероксидазы, чем система ОФД-ЦФР (ортофенилендиамин - цитратно-фосфатный раствор) и, кроме того, менее токсична.

Реагент 7 (Р7) - стоп-реагент (кислота серная (ГОСТ 4204-79). 1N].

Чувствительность полуколичественного метода анализа оценивается минимальным уровнем IgE-антител (1 класс), при котором cuie можно обнаружить в иммуноферментной реакции различие в оптической плотности между КПО и КПО, не содержащей IgE-антитела.

Точность определяется способностью тест-системы давать одинаковые результаты при тестировании одной и той же сыворотки на одном стрипе. Выражается коэффициентом вариации различных специфичностей в 8 репликантах каждого образца сыворотки.

Перед началом работы набор извлекают из холодильника и выдерживают в течение 30 мин. при комнатной температуре. Реагенты перед использованием тщательно перемешивают и готовят рабочие растворы:

Промывающий раствор, 10-кратный концентрат, разводят в 10 раз дистиллированной водой. К одному объему Р5 добавляют 9 объемов дистиллированной воды, рН 7,4.

Рабочий раствор конъюгата МКАТ анти IgE готовят путем разведения в 100 раз промывающим раствором.

Рабочий раствор субстрат хромогенной смеси готовится смешиванием равных частей Р6 и Р7. Раствор стабилен в течение 1 часа после приготовления.

Во все лунки стрипов вносят по 90 мкл промывающего раствора. В лунки А-Н первого ряда вносят по 10 мкл калибраторов в дублях. 8 остальные лунки вносят по 10 мкл исследуемых сывороток. Планшет накрывают крышкой, перемешивают на шейкере или вручную в течение 1 мин, татем помещают в термостат на 1 час при t° +37°С.

Содержимое лунок удаляют путем стряхивания из перевернутого планшета. Во все лунки планшета вносят по 150 мкл промывающего раствора, удаляют путем стряхивания. Процедуру повторяют 3 раза. Во все лунки вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата. Планшеты инкубируют в течение 1 часа при температуре +37°С. Повторяют процедуру промывания 3 раза промывающим раствором и 2 раза -дистиллированной водой.

Во все лунки планшета вносят по 100 мкл субстрат хромогенной смеси. Выдерживают в защищенном от света месте при комнатной температуре в течение 5-30 мин.

Вносят стоп-реагент по 50 мкл в каждую лунку планшета. Учет проводят на спектрофотометре вертикального тасанирования при длине волны 450 нм. Анализ считается действительным, если:

- ОП КПО не превышает 0,2;

- ОП КПА превышает 1,5;

- ОП КПО превышает показатели ОП КПО.

Рассчитывают среднюю арифметическую между показателями ОП дублей каждого из тестируемых образцов сывороток. Если ОЛ тестируемой сыворотки выше ОП раствора КПА, то уровень содержания аллергенспецифических IgE-антител соответствует 3 классу и т.д. В учете результатов реакции, с целью контроля за специфической и неспецифической терапией, предлагается определение количественного содержания специфических IgE-антител по калибровочному графику. На линейной миллиметровой бумаге на оси У откладываются показатели оптической плотности, на оси Х - значения концентрации калибраторов.

Сравнительный анализ исследований сыворотки пациентов в предлагаемой полезной модели проводили с исследованиями этих же образцов сывороток с использованием диагностического набора по определению специфических IgE - антител к пищевым аллергенам фирмы ФГУП «Аллеррен», г. Ставрополь.

Исследовалась сыворотка 100 пациентов, мужчин и женщин в возрасте от 18 до 60 лет (средний возраст 35±3,1). Обследуемые пациенты были разделены на 2 группы в соответствии с диагнозами:

- 1 группу составили 70 человек (средний возраст 31±3,1) с диагнозом: аллергический ринит;

- 2 группу - 30 человек (средний возраст 34±2,1) составили практически здоровые сотрудники лаборатории Центра Специализированных видов медицинской помощи.

Результаты определения специфических IgE-антител между тест- системой IgE-AT-ИФА и тест-системой фирмы ФГУП «Аллерген» в контрольной и опытной группах представлены в Таблицах 1 и 2 соответственно, Существенные отличия, отмечаемые в результатах оценок аллергенов домашней и библиотечной пыли. подсолнечника, райграса, полыни, березы, ольхи могут быть обусловлены более высокой чувствительностью субстрат-хромогенной смеси. В остальном значимых отличий в показателях не отмечено.

Таким образом, полученные результаты сравнения позволяют сделать вывод о том, что предлагаемая полезная модель в виде тест-системы для полуколичественного иммуноферментного определения специфических IgE-антител в сыворотке крови человека (IgE-AT-ИФА) может конкурировать как с зарубежными, так и с отечественными аналогами. Минимальное количество сыворотки, расходуемой на 1 аллерген (10 мкл) позволяет рекомендовать использование тест-системы как в практическом здравоохранении вообще, так и в педиатрии, в частности.

Предлагаемая полезная модель:

1. Позволяет определять специфические IaE-антитела к широкому спектру отечественных аллергенов, определяемых как «региональные»;

2. Дешева, с достаточно коротким временем постановки, что позволяет ее использование в скрининговых исследованиях;

3. Безопасна в диагностике;

4. Высокочувствительна и воспроизводима;

5. Использование предлагаемой полезной модели возможно в любой клинической лаборатории, имеющей планшетный или стриповый спектрофотометр.

Таблица 1
Уровень общего IgE у больных аллергическим ринитом (n=70)
Уровень общего IgE (M±m, ME/мл)Количество больных пищевой аллергией
146,9±14,334
356,3±15,2 23
604,7±28,8 13
Таблица 2
Уровень общего IgE в контрольной группе (n=30)
Уровень общего IgE (M±m, ME/мл)t Количество обследуемых
42,7±14,2 16
136,5±9,3 13
>200 1

Таблица 3
Сравнение диагностической эффективности тест-системы IgE-AT-ИФА и набора по определению специфических IgE-антител к пищевым аллергенам фирмы ФГУП «Аллерген» г. Ставрополь
Наименование аллергенаIgG-AT-ИФА - классы (частота выявления, %) ФГУП «Аллерген» классы (частота выявления, %)
 0 12 34 01 23 4
 n%n %n% n%n %n%n% n%n %n%
Апельсин12 17,12130 2738,69 12,971,41014,3 2535,728 40710 00
Мандарин1420 2535,729 41,422,9 001622,823 32,83042,8 34,30 0
Лимон912,918 25,72941,4 1217,12 2,91115,71927,1 2637,112 17,222,9
Белок куриных яиц1014,323 32,82130 1115,74 5,71318,62130 2231,49 12,957,1
Желток куриных яиц 2535,714 202941,4 22,90 02434,31622,8 2738,62 2,911,4
Домашняя пыль1927,120 28,62332,9 68,62 2,928402029 20292 2,900
Библиотечная пыль213021 302434,3 34,31 1,42332,82332,8 2231,42 2,900
Райграс17 24,32130 2332,87 1022,92029 2434,320 2957,1 11,4
Полынь2840 142017 24,31014,3 11,43651,415 21,41420 57,10 0
Береза2434,317 24,32029 811,41 1,421302130 2434,34 5,700
Ольха24 34,31217,2 3348,11 1,411,42130 142035 5000 00
Хек1927,1 2332,823 32,845,7 11,42231,421 302434,3 22,91 1,4
Подсолнечник 213021 301927,1 7102 2,92637,12231,4 1825,74 5,700
Гречневая крупа2637,123 32,81217,1 912,90 02738,62535,7 14204 5,700
Овсяная крупа27 38,62231,4 1521,46 8,6002738,6 2637,111 15,757,1 11,4
Пшеничная мука2231,4 1825,724 34,357,2 11,42535,720 292130 45,70 0
Ржаная мука 1622,819 27,12738,6 68,62 2,91927,12738,6 1622,87 1011,4
Рисовая крупа23 32,81217,2 2332,89 12,934,32130 1318,624 34,31115,7 11,4
Ячменная крупа2434,3 2332,819 27,134,3 11,42535,725 35,71724,3 34,30 0
Примечание: жирным шрифтом выделены аллергены, показатели которых значительно отличаются от показателей тест-системы фирмы ФГУП «Аллерген

Тест-система для полуколичественного иммуноферментного определения аллергенспецифических IgE-антител в сыворотке крови человека (IgE-АТ-ИФА), представляющая набор реагентов и включающая твердофазный носитель с иммобилизованными аллергенами, калибраторы, промывочный раствор, конъюгат, субстрат, хромоген, стоп-реагент, отличающийся тем, что тест-система расположена в коробке, твердофазный носитель представляет собой стрипованные планшеты, калибраторы представляют собой жидкие калибровочные пробы, готовые к использованию, а в качестве хромогена используют субстрат-хромогенную смесь.



 

Похожие патенты:

Эндоскоп // 115188

Полезная модель относится к области клинической медицины, в частности онкологии, и может быть использовано для терапии патологического роста клеток организма в биологическом объекте. Устройство предназначено для лечения раковых опухолей папилломовирусной инфекции, т.е. новообразований на коже типа папиллом. Устройство снабжено ванной, заполняемой электролитом из раствора морской соли, а электроды, прижимаемые к поверхности кожи пациента по разные стороны от раковой опухоли размещены внутри ванны в указанном электролите.

Полезная модель относится к газоразрядной технике и может быть использована при разработке средств отображения информации на цветных газоразрядных индикаторных панелях (ГИП) переменного тока планарной конструкции

Полезная модель относится к области спектрофотометрии и может быть использована при анализе состава жидкого вещества и пространственного распределения структурной его единицы.
Наверх