Биосенсор для определения бензоата натрия
Полезная модель относится к области охраны окружающей среды, пищевой промышленности и биотехнологии, а именно к биосенсорным аналитическим устройствам. Устройство может быть использовано для экспресс-определения содержания бензоата натрия в водных растворах. Предложен биосенсор для определения бензоата натрия на основе измерения скорости потребления кислорода бактериальными клетками рецептора, включающий электрод Кларка, сопряженный с биорецептором, представляющим собой иммобилизованные на носителе клетки актинобактерий Rhodococcus rhodnii 135.
Полезная модель относится к области охраны окружающей среды, пищевой промышленности и биотехнологии, а именно к биосенсорным аналитическим устройствам. Устройство может быть использовано для экспресс-определения содержания бензоата натрия в водных растворах.
Бензоат натрия (Б-Na) - это натриевая соль бензойной кислоты C6H5COONa. Бензоат натрия (код E211) зарегистрирован как пищевая добавка и применяется в пищевой промышленности в качестве консерванта для консервирования мясопродуктов, рыбных изделий, маргарина, плодово-ягодных продуктов, сладких безалкогольных напитков, алкогольных напитков с уровнем алкоголя менее 15%, пива и пр. Как консервант его используют и в косметической, а также в фармацевтической промышленности [Ксу X., Дьяо Т, 2008. Фармацевтическая композиция для чистки кишечника. Патент РФ 
2472527]. Кроме того, бензоат натрия применяют в авиационной промышленности и пиротехнике; в химической промышленности его используют при производстве клеев, красителей, стабилизаторов полимеров.
Использование Б-Na в качестве консерванта основано на том, что он угнетает рост дрожжей и плесневых грибов, подавляя в клетках активность ферментов, ответственных за окислительно-восстановительные реакции м расщепление жиров и крахмала. Кроме того, по данным [P.W. Piper. Yeast superoxide dismutase mutants reveal a pro-oxidant action of weak organic acid food preservatives. Free Radic. Biol. Med., 1999, Vol. 27, pp. 1219-1227], Б-Na оказывает мутагенное действие на митохондриальную ДНК (не надо забывать, что существует множество болезней человека, которые связаны именно с повреждением части ДНК) и, по мнению автора, злоупотребление бензоатом натрия может вызвать у человека окислительный стресс в клетках эпителия желудочно-кишечного тракта. По данным ВОЗ [World Health Organization, Concise International Chemical Assessment Document 26: Benzoic acid and sodium benzoate. World Health Organization: Geneva, 2000, 48 с] при исследовании воздействия этого вещества на млекопитающих, несмотря на относительную безвредность бензоата натрия, встречались аллергии (дерматит) и незначительные побочные эффекты, такие как обострение симптомов при астме и крапивнице; также, ввиду недостаточных исследований, эксперты не исключают возможность генотоксической активности этого соединения. Кроме того, не следует применять бензоат натрия вместе с аскорбиновой кислотой, так как в результате соокисления (чему способствует высокая температура и освещение) образуется канцерогенное вещество - бензол. В ряде европейских стран рекомендовано вывести из употребления ряд искусственных красителей, которые в комбинации с Б-Na оказывают негативное влияние на поведение и интеллект детей. Поэтому, хотя допустимая концентрация бензоата натрия достаточно высока: от 0.15 до 0.25%, а допустимое суточное потребление составляет 5 мг/кг массы тела, закономерен интерес исследователей к мониторингу содержания этого соединения.
Кроме того, бензоат натрия широко используется в академических исследованиях при изучении путей утилизации и деструкции ароматических соединений микроорганизмами [Sandra Haddad, D. Matthew Eby, Ellen L. Neidle. Cloning and Expression of the Benzoate Dioxygenase Genes from Rhodococcus sp. Strain 19070. Appl. Environ. Microbiol., 2001, Vol. 67, No. 6, p. 2507-2514; S. Harayama, M. Rekik, A. Bairoch, E.L. Neidle, L.N. Ornston. Potential DNA slippage structures acquired during evolutionary divergence of Acinetobacter calcoaceticus chromosomal benABC and Pseudomonas putida TOL pWW0 plasmid xylXYZ, genes encoding benzoate dioxygenases. J. Bacteriol., 1991, Vol. 173, p. 7540-7548; Becky M. Bundy, Alan L. Campbell, Ellen L. Neidle. Similarities between the antABC-encoded anthranilate dioxygenase and the benABC-ehcoded benzoate dioxygenase of Acinetobacter sp. strain ADP1. J. Bacteriol., 1998, Vol. 180, p. 4466-4474; Kitagawa W., Miyauchi K., Masai E., Fukuda M. Cloning and characterization of benzoate catabolic genes in the gram-positive polychlorinated biphenyl degrader Rhodococcus sp. strain RHA1 J. Bacterid,. 2001, Vol. 183, p. 6598-6606; Janke D. Al-Mofarji T., Straube G., Schumann P., Prauser H. Critical steps in degradation of chloroaromatics by rhodococci. I. Initial enzyme reactions involved in catabolism of aniline, phenol and benzoate by Rhodococcus sp. An 117 and An 213. J. Basic Microbiol., 1988, Vol. 28, p. 509-518; Haddad S., Eby D.M., Neidle E.L. Cloning and expression of the benzoate dioxygenase genes from Rhodococcus sp. strain 19070. Appl. Environ. Microbiol., 2001, Vol. 67, p. 2507-2514; Briganti F., Pessione E., Giunta C., Mazzoli R., Scozzafava A. Purification and catalytic properties of two catechol 1,2-dioxygenase isozymes from benzoate-grown cells of Acinetobacter radioresistens. J. Protein. Chem., 2000, Vol. 19, p. 709-716], что требует несложного экспресс-метода для контроля за содержанием Б-Na в средах.
Известный хроматографический метод определения бензоата натрия (метод высокоэффективной жидкостной хроматографии) предусматривает использование дорогостоящего стационарного оборудования и токсичного растворителя - ацетонитрила (ГОСТ 30059-93. Напитки безалкогольные. Методы определения аспартама, сахарина, кофеина и бензоата натрия). Метод является арбитражным. Также возможно ацидиметрическое определение бензоата натрия в присутствии смешанного индикатора, требующее применения диэтилового эфира для извлечения выделяющейся бензойной кислоты. Но в этом случае содержание бензоата в пробе должно быть не менее 58% в пересчете на сухое вещество.
Более оперативные методы определения содержания Б-Na основаны на использовании сенсорных анализаторов.
Имеются сообщения о разработке потенциометрического мембранного сенсора и тест-полосок на основе фермента тирозиназы для определения бензойной кислоты [Agnieszka Krajewska, Pavel Lhotak, Hanna Radecka. Potentiometric responses of ion-selective tlectrodes dopedwith Potentiometric responses of ion-selective tlectrodes dopedwith diureidocalix[4]arene towards un-dissociated benzoic acid. Sensors. 2007, 7, p. 1655-1666; Hairul Hisham Hamzah. Nor Azah Yusof. Abu Bakar Salleh. Fatimah Abu Bakar. An optical test strip for the detection of benzoic acid in food. Sensors. 2011, 11, p. 7302-7313].
Задача, на решение которой направлена заявляемая полезная модель - создание простого по конструкции и эксплуатации устройства для определения Б-Na в водной среде.
Технический результат, который может быть получен при использовании полезной модели, заключается в том, что предлагаемый биосенсор обеспечивает быстрое определение содержания бензоата натрия без использования сложного стационарного дорогостоящего оборудования и легковоспламеняющихся и токсичных растворителей (таких как ацетонитрил и диэтиловый эфир), нижний предел детекции - 1×10-6 М.
Сущность полезной модели заключается в том, что биосенсор для определения бензоата натрия включает электрод Кларка, сопряженный с биорецептором, содержащим иммобилизованные на носителе клетки актинобактерий Rhodococcus rhodnii 135.
На фиг. 1 представлена схема биосенсора для определения бензоата натрия.
Биосенсор для определения бензоата натрия включает электрод Кларка 1 (фиг. 1), на котором размещен биорецептор 2, содержащий иммобилизованные на носителе клетки актинобактерий Rhodococcus rhodnii 135. Биорецептор 2 прикрепляется к электроду с помощью фиксатора 3. Фиксатор представляет собой пластиковое кольцо диаметром, соответствующим размеру электрода. На кольце закреплена однонитевая нейлоновая сетка, которая, по желанию исследователя, может быть заменена на любой крупноячеистый гибкий полимерный материал, не вступающий в химическую реакцию с анализируемым образцом.
На фиг. 2 представлена градуировочная кривая зависимости ответа биосенсора на основе иммобилизованных клеток актинобактерий Rhodococcus rhodnii 135 от концентрации бензоата натрия.
Для создания биорецептора используют клетки актинобактерий Rhodococcus rhodnii 135 из коллекции культур лаборатории энзиматической деградации органических соединений ИБФМ РАН. Штамм обладает способностью к утилизации бензоата натрия и используется для изучения ферментов, участвующих в разложении ароматических соединений [Соляникова И.П., Головлев Е.Л., Лисняк О.В., Головлева Л.А. Выделение и характеристика пирокатехаз из штаммов Rhodococcus rhodnii 135 и Rhodococcus rhodochrous 89: сравнение с аналогичными ферментами обычного и модифицированного орто-пути. Биохимия, 1999, Т. 64, 7, стр. 982-989; Jadan А.Р., Golovleva L.A., Rietjens I.M.C.M., Boeren S., van Berkel W.J.H. Regioselectivity of hydroxylation of p-hydroxybenzoate hydroxylase from Rhodococcus rhodnii 135 and Rhodococcus opacus 557, p.963-968. In: Flavins and Flavoproteins, 2002 (R.N. Perham, S. Chapman, N. Scrutton (eds)) Cambridge, United Kingdom, Agency for Scientific Publications, Berlin 2002].
Штамм Rhodococcus rhodnii 135 поддерживают на пептон-триптонной агаризованной среде следующего состава: амино-пептид - 60 мл/л, триптон - 5 г/л, дрожжевой экстракт - 1 г/л, соевый пептон - 5 г/л, агар-агар - 20 г/л, вода дистиллированная - до 1 литра, pH - 6.9-7.3 - при +4°C. Пересев осуществляют каждые 6 месяцев. Для получения биомассы, культуру выращивают в пробирках на агаризованной пептон-триптонной среде указанного состава при температуре 28°C в течение 18 часов. Биомассу снимают с поверхности агара и суспензируют в 50 мМ калий-натрии фосфатном буфере (pH 7.4); концентрация суспензии - 100 мг влажных клеток в мл. Полученную суспензию бактериальных клеток выдерживают в течение 24 часов при температуре +4°C, а затем используют для приготовления биорецептора.
Для формирования биорецептора суспензию бактерий Rhodococcus rhodnii 135 иммобилизуют на мембране (хроматографическая стекло-бумага Whatman) методом физической сорбции: 10 микролитров суспензии наносят на фрагмент бумаги (4×4 мм) в виде капли диаметром 3-4 мм. Полученный биорецептор подсушивают на воздухе в течение 30-40 минут и фиксируют на измерительной поверхности кислородного электрода Кларка с помощью фиксатора или хранят в холодильнике при температуре +4°C.
Принцип определения бензоата натрия основан на измерении скорости потребления кислорода клетками бактерий биорецептора в результате активирующего действия бензоата натрия на метаболизм клеток Rhodococcus rhodnii 135.
Биосенсор для определения бензоата натрия работает следующим образом. Электрод Кларка 1 с зафиксированным на нем биорецептором 2, содержащим иммобилизованные клетки штамма Rhodococcus rhodnii 135, помещают в измерительную кювету с 50 мМ калий-натрий фосфатным буфером (pH 7.4) и регистрируют силу тока, отражающую содержание кислорода в буфере (базовый уровень). Все измерения проводят при комнатной температуре и при постоянном перемешивании. Затем добавляют аликвоту анализируемого образца и регистрируют изменение силы тока, отражающее снижение содержания кислорода в буферном растворе. Рассчитывают максимальную скорость изменения силы тока (ответ биосенсора, dI/dt в pA/c), связанную пропорциональной зависимостью со скоростью изменения концентрации потребленного кислорода, и определяют концентрацию Б-Na по предварительно построенной градуировочной кривой (фиг. 2). Измерения проводят при комнатной температуре и постоянном перемешивании.
Таким образом, предлагаемый биосенсор обеспечивает быстрое определение содержания Б-Na без использования сложного дорогостоящего оборудования, опасных веществ и не требует больших затрат на изготовление.
Биосенсор для определения бензоата натрия в водном растворе, включающий кислородный электрод Кларка с зафиксированным на нем биорецептором, содержащим иммобилизованные на хроматографической стекло-бумаге Whatman клетки актинобактерий Rhodocuccus rhodnii 135.
РИСУНКИ
