Клеточный имплантат для восстановления дефектов кожного покрова

Клеточный имплантат выполнен в виде живого эквивалента кожи. Он содержит подложку биоматрикса, образующую трехмерный каркас и являющейся стромой для новой формирующейся ткани. Подложка биоматрикса выполнена из биосовместимого биополимера, такого как коллагеновый гель, колагенновая губка или коллаген-хитозановая губка. В структуру подложки биоматрикса включена эмульсия перфторуглеродов. Такая структура подложки биоматрикса создает оптимальные условия для культивирования клеток in vitro, обеспечивая достаточный газообмен и снабжение питательными веществами, а также для ускорения процесса регенерации и формирования полнослойной кожной ткани in vivo за счет улучшения питания и тканевого дыхания, ослабления развития ишемического отека, уменьшения плазмопотери и сгущения крови, восстановления микроциркуляции пораженной ткани. Внутри подложки биоматрикса распределены аллогенные мезенхимальные клетки человека. В качестве аллогенных мезенхимальных клеток человека используют фибробробласты или мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани человека или их смесь, с концентрацией клеток не менее, чем 0,8*10⁵ /см² имплантата. Сверху подложка покрыта слоем эпидермальных кератиноцитов, выделенных из биоптатов кожи, полученных в результате косметологических операций. Имплантат предназначен для лечения дефектов кожных покровов различной этиологии и тяжести, включая травматические и ожоговые поражения кожи, длительно незаживающие раны на фоне трофических нарушений различной этиологии (артериальная и венозная недостаточность, сахарный диабет и другие виды дефектов).

Полезная модель относится к области медицины, медицинских технологий и биоинженерии, в частности, к тканеинженерным конструкциям для регенеративной медицины, и может быть использована для лечения повреждений кожных покровов различной этиологии и тяжести, включая травматические и ожоговые поражения кожи, длительно незаживающие раны на фоне трофических нарушений различной этиологии (артериальная и венозная недостаточность, сахарный диабет и др.).

Несмотря на успехи современной медицины лечение обширных кожных дефектов, в, том числе ожогов, трофических язв и длительно незаживающих ран, является сложной проблемой, не имеющей до сих пор удовлетворительного разрешения. Применяемые традиционные методы лечения таких дефектов дают положительный эффект приблизительно в 75% - 80% случаев. При этом длительность лечения составляет в среднем 1,5-2 месяца и зачастую не обеспечивает полную реэпителизацию кожного дефекта. Достаточно часто развиваются рецидивы.

В связи с недостаточной эффективностью и ограниченными возможностями традиционных методов лечения дефектов кожи различной этиологии, в последнее время активно разрабатываются клеточные имплантаты, способные временно замещать поврежденные или утраченные слои кожи, стимулировать процессы регенерации в тканях донора и, в конечном итоге, приводить к восстановлению целостности кожного покрова.

Клеточные имплантаты для восстановления кожных дефектов представляют собой созданные биотехнологическим путем тканеинженерные конструкции, в которых живые клеточные элементы кожной ткани (кератиноциты и мезенхимальные клетки) объединены с носителем биоматриксом. Восстановление целостности кожного покрова при использовании клеточного имплантата происходит за счет закрытия кожного дефекта имплантатом, стимуляции репаративных процессов в ране и последующего замещения клеточного имплантата вновь образованными элементами эпидермального и дермального слоев кожи.

Такие созданные in vitro клеточные имплантаты, включающие эпидермальные и дермальные клетки, получили название «живой эквивалент кожи».

Эффективность эпителизации, способность к замещению имплантата собственными клетками кожи и восстановлению целостности кожного покрова при применении живого эквивалента кожи главным образом зависят от свойств материала носителя биоматрикса, состава и характеристик клеточных элементов имплантата.

Известен композиционный эквивалент живой кожи, включающий эпидермальный слой культивированных кератиноцитов, слой беспористого коллагена и дермальный слой культивированных фибробластов в пористой сшитой коллагеновой губчатой матрице (Патент RU 2135191 на изобретение «Композиционный эквивалент живой кожи, способ его получения, тест-набор», А61К 35/36, опубл. 27.08.1999).

В патенте на полезную модель RU 94151 описано биологически активное раневое покрытие для лечения ран, состоящее из гидратированной целлюлозы микробного происхождения и наслоенного на нее слоя коллагенового геля, причем в слоях покрытия находятся в разных комбинациях фибробласты, тромбоциты крови, мезенхимальные стволовые клетки, постнатальные кератиноциты человека, ростовая среда для них, а также предотвращающие их гибель антибиотики широкого спектра действия (Патент RU 94151 на полезную модель «Биологически активное покрытие для лечения ран», А61F 13/02, опубл. 20.05.2010).

В патенте на изобретение RU 2254146 описан биотрансплантат для восстановления кожного покрова, представляющий собой многокомпонентную объемную трехмерную структуру, выполненную в виде коллагенового геля или губки, или сетчатой структуры, и содержащую аллогенные клетки мезенхимы и эпителия человека и, по крайней мере, один слой из биосовместимого полимера в виде сетчатой матрицы внутри коллагеновой структуры. Трансплантат пригоден для регенеративной и репаративной реконструкции любых биологических структур, в том числе для восстановления кожных покровов при ожогах, трофических язвах и ранах любой этиологии (Патент RU 2254146 на изобретение «Активный биологический комплекс для органогенеза», A61L 27/24, опуб. 20.06.2005).

Наиболее близким аналогом к предлагаемой полезной модели является имплантат для восстановления дефектов кожного покрова, представляющий собой эквивалент кожи, включающий трехмерную матрицу из белков внеклеточного матрикса с мезенхимальными клетками внутри нее и эпидермальными клетками на ее поверхности. Формирующая основу имплантанта матрица изготавливается из биосовместимого биополимера на основе коллагенового или фибринового геля. В качестве мезенхимальных клеток могут использоваться эмбриональные или постнатальные фибробласты человека или аутологичные или аллогенные мезенхимальные стволовые клетки красного костного мозга с концентрацией клеток 100 тыс./мл геля, а в качестве эпидермальных клеток используется отселектированная популяция базальных стволовых кератиноцитов, характеризующаяся наличием специфического маркера р63. Такой эквивалент кожи пригоден для использования немедленно или в течение 2-3 дней при его хранении в условиях 5% СО₂ при 37°С (Патент RU 2342164 на изобретение «Эквивалент кожи и способ его получения», A61L 27/60, опубл. 27.12.2008).

Общим недостатком известных клеточных имплантатов, включая принятый в качестве прототипа эквивалент кожи, является то, что они не создают при имплантации оптимальных условий для полноценного восстановления глубоких дефектов кожного покрова.

Одной из причин недостаточной эффективности применения известных эквивалентов кожи, является то, что ткани пациента при повреждении кожного покрова зачастую подвергнуты ишемии из-за недостатка кровоснабжения и кислорода в зоне дефекта, что значительно затрудняет процесс регенерации тканей. Однако в состав материала матрицы аналогов и прототипа заявленной полезной модели не входят элементы, обеспечивающие возможность устранить гипоксию клеток и тканей в зоне поврежденных ишемизированных тканей и создать оптимальную микросреду для регенерациикожной ткани.

Еще одним недостатком известных аналогов и прототипа является крайне короткий срок годности имплантата.

Задачей, на решение которой направлена предлагаемая полезная модель, является устранение указанных недостатков, а именно, создание клеточного имплантата, позволяющего повысить качество лечения кожных дефектов различной этиологии и тяжести, сократить сроки лечения, снизить риски осложнения за счет устранения нежелательных явлений гипоксии и ишемии в поврежденных тканях и обеспечения оптимальной газовой и питательной микросреды для регенерации.

Технический результат, получаемый при использовании полезной модели, заключается в повышении качества лечения, ускорении заживления кожных дефектов, в полноценном восстановлении всех слоев кожи за счет устранения нежелательных явлений гипоксии и ишемии в зоне кожного дефекта и обеспечения оптимальной газовой и питательной микросреды для пролиферации клеток.

Достижение технического результата обеспечивается тем, что клеточный имплантат содержит подложку биоматрикса, выполненную из биополимера, выбранного из группы: коллагеновый гель, колагенновая губка или коллаген-хитозановая губка, в структуру которого включена эмульсия перфторуглеродов.

Такая структура подложки биоматрикса за счет присутствия в ней перфторуглеродов позволяет создать оптимальные условия как для культивирования клеток in vitro, обеспечивая достаточный газообмен и снабжение питательными веществами, так и для ускорения процесса регенерации и формирования полнослойной кожной ткани in vivo за счет улучшения питания и тканевого дыхания, ослабления развития ишемического отека, уменьшения плазмопотери и сгущения крови, восстановления микроциркуляции пораженной ткани.

Сущность полезной модели заключается в следующем:

Клеточный имплантат для восстановления дефектов кожного покрова конструктивно выполнен в виде живого эквивалента кожи. Он содержит подложку биоматрикса, образующую трехмерный каркас и являющейся стромой для новой формирующейся ткани. Подложка биоматрикса выполнена из биосовместимого биополимера, выбранного из группы: коллагеновый гель, колагенновая губка или коллаген-хитозановая губка, в структуру которого включена эмульсия перфторуглеродов.

Внутри подложки биоматрикса распределены аллогенные мезенхимальные клетки человека. В качестве аллогенных мезенхимальных клеток человека используют фибробробласты или мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани (ММСК ЖТ) человека или их смесь, с концентрацией клеток не менее, чем 0,8*10⁵ /см² имплантата. Сверху подложка биоматрикса покрыта слоем эпидермальных кератиноцитов, выделенных из биоптатов кожи, полученных в результате косметологических операций. Источником для получения ММСК человека служат излишки кожи и жира после пластических операций (блефаропластика, фейслифтинг, абдоминопластики). Эпидермальные и мезенхимальные клетки являются биологически активным компонентом имплантата, инициирующим восстановление кожного покрова.

Полезная модель имеет следующие отличия от прототипа:

- подложка биоматрикса выполнена из биополимера, выбранного из группы: коллагеновый гель, колагенновая губка или коллаген-хитозановая губка, в структуру которого включена эмульсия перфторуглеродов;

- в качестве аллогенных мезенхимальных клеток человека используют фибробробласты или мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани человека или их смесь, с концентрацией клеток не менее, чем 0,8*10 ⁵ /см² имплантата.

Указанные отличительные признаки являются существенными и взаимосвязаны с образованием устойчивой совокупности существенных признаков, достаточной для получения требуемого технического результата.

Перфторуглероды (ПФУ) - известная группа соединений, представляющая собой продукты фторирования различных органических соединений. Это слабо полярные соединения, в которых растворимость газов увеличивается по мере уменьшения полярности. Эти соединения обладают полифункциональным действием: улучшают газообмен и метаболизм на уровне тканей, являются мембраностабилизирующими, уменьшают ацидоз в тканях, обладают сорбционными свойствами, улучшают периферическую микроциркуляцию, стимулируют фагоцитоз. Эти свойства обусловливают перспективность использования ПФУ в качестве контрастной среды, агентов по переносу кислорода или "искусственной крови" при лечении сердечных приступов, инсульта и других сосудистых заболеваний, в качестве адъювантов при коронарной ангиопластике и в лучевой и химиотерапии рака.

В качестве эмульсии перфторуглеродов в структуру биополимера подложки биоматрикса может быть включена любая известная эмульсия индивидуальных перфторсоединений или эмульсия нескольких перфторсоединений, например, известные отечественные препараты "Перфторан®", "Перфузоль®", "Фторем®"; американские - "Oxygent®", "Imagent®", "AT-0101®", "АТ-0140®", "AT-0144®" (Alliance Pharmaceutical Corp., San Diego, CA, USA); японский - "Fluosol DA®" (Green Cross Corporation, Osaka); китайский - "Эмульсия 11®".

Сравнение предлагаемого клеточного имплантата для восстановления дефектов кожного покрова с другими тканеинженерными конструкциями, известными в области медицины, показало его соответствие критериям полезной модели. Все элементы заявляемого клеточного имплантата для восстановления дефектов кожного покрова являются однозначно идентифицируемыми, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «промышленная применимость». При анализе уровня техники заявителем не выявлены технические решения, относящиеся к клеточным имплантатам для восстановления дефектов кожного покрова, которым присущи все существенные признаки заявленной полезной модели, что свидетельствует о соответствии критерию «новизна».

Кроме того, выполнение подложки биоматрикса из биополимера, содержащего ПФУ, для решения поставленной задачи не является очевидным решением для специалистов в области медицины, медицинских технологий и биоинженерии.

На фиг.1-3 представлена схема клеточного имплантата (живого эквивалента кожи), которое имеет разные модификации по составу клеточных элементов.

На фиг.1 представлена схема клеточного имплантата (живого эквивалента кожи), где:

1 - эпидермальный слой (кератиноциты)

2 - подложка биоматрикса (коллагеновый гель, колагенновая или коллаген-хитозановая губка)

3 - перфторуглерод (ПФУ)

4 - мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани (ММСК ЖТ).

На фиг.2 представлена схема клеточного имплантата (живого эквивалента кожи), где:

1 - эпидермальный слой (кератиноциты)

2 - подложка биоматрикса (коллагеновый гель, колагенновая или коллаген-хитозановая губка)

3 - перфторуглерод (ПФУ)

5 -фибробласты.

На фиг.3 представлена схема клеточного имплантата (живого эквивалента кожи), где:

1 - эпидермальный слой (кератиноциты)

2 - подложка биоматрикса (коллагеновый гель, колагенновая или коллаген-хитозановая губка)

3 - перфторуглерод (ПФУ)

4 - мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани (ММСК ЖТ)

5 - фибробласты.

Клеточный имплантат для восстановления дефектов кожного покрова, имеющий указанные выше модификации, получают следующим образом.

1. Изготовление клеточного имплантата на основе коллагенового геля с ПФУ.

Подложку биоматрикса на основе коллагенового геля с ПФУ получают простым смешиванием всех его компонентов при температуре 0-+4°С.

Сначала готовят кондиционную среду: стерильный 0,34 М раствор NaOH соединяют с концентрированной (×10) питательной средой 199 в соотношении 1:2 и на каждые 100 мл смеси добавляют 100 мг глутамина, 10% эмбриональной, телячьей сыворотки (HyClone, USA) или среды DMEM и 9 мл 7,5%-ного раствора бикарбоната натрия.

Для приготовления носителя биоматрикса в раствор коллагена в уксусной кислоте вносят 10% ПФУ и перемешивают. Полученную смесь соединяют с кондиционной средой в соотношении 4:1 на ледяной бане для предотвращения преждевременной полимеризации.

Далее в полученный носитель биоматрикса вносят суспензию фибробластов в ростовой среде и разливают в чашки Петри (Nunc, Дания) необходимой площади (диаметром 35 мм или 50 мм) с неадгезивной поверхностью. Концентрация фибробластов в подложке биоматрикса составляет не менее, чем 0,8*10⁵ /см².

В альтернативных вариантах исполнения клеточного имплантата взамен фибробластов в подложку биоматрикса вносят МСК ЖТ или смесь фибробластов с МСК ЖТ с концентрацией клеток не менее, чем 0,8*10⁵ /см² имплантата.

Чашки Петри помешают в инкубатор при 37°С на 10-20 мин для полимеризации геля. После полимеризации на поверхность геля, для создания полноценного ЖЭК, наносят суспензию кератиноцитов в концентрации 2*10 ⁵ кл/см² и культивируют в полной ростовой среде для кератиноцитов с добавлением 10% ПФУ (во избежание вымывания ПФУ из биоматрикса). Через 3 суток на поверхности носителя биоматрикса образовывается монослой эпителиальных клеток.

Полученные клеточные имплантаты, представляющие собой живой эквивалент кожи (ЖЭК), упаковывают поштучно в стерильный индивидуальный пакет из многослойной полимерной пленки или одноразовую пластиковую чашку Петри. Пакет или чашку помещают в запаянный пакет из поливинилхлоридной (ПВХ) пленки.

2. Изготовление живого эквивалента кожи (ЖЭК) на основе хитозан-коллагеновой губки.

Для изготовления клеточного имплантата используется коммерческий продукт - коллаген-хитозановая губка «Коллахит-Г».

Из губки «Коллахит-Г» вырезают к вадраты нужного размера и размещают их в лунках 6-луночного плата. Перед посевом клеток губки промывают раствором Хэнкса с гентамицином и вносят 10% ПФУ. Затем на поверхность губок осуществляют посев мезенхимальных клеток (ММСК ЖТ, фибробластов или смесь фибробластов с ММСК ЖТ) в питательной среде и помещают полученную подложку биоматрикса в СО₂ - инкубатор на 1 сутки. Спустя сутки подложку биоматрикса с клетками при помощи пинцета переворачивают стороной заполненной клетками вниз, удаляют всю питательную среду. Затем наносят на свободную поверхность суспензию кератиноцитов в количестве 300 тыс.кл. на губку и заливают полной питательной средой, содержащей 10% ПФУ. Культивирование живого эквивалента кожи проводят в течение недели в СО₂-инкубаторе.

Внешний вид ЖЭК представляет собой плоскую губку, толщиной 0,5-2 мм, коричнево-розового цвета.

Клеточный имплантат может выпускаться в двух формах выпуска, отличающихся по площади:

- 10 см* 10 см (площадь 100 см ²)

- 5 см* 5 см (площадь 25 см² ).

Полученный клеточный имплантат упаковывают поштучно в стерильный индивидуальный пакет из многослойной полимерной пленки или одноразовую пластиковую чашку Петри. Пакет или чашку помещают в запаянный пакет из поливинилхлоридной (ПВХ) пленки.

Гарантийный срок хранения клеточного имплантата:

- в условиях криозаморозки (-196°С) - не менее года;

- при комнатной температуре (+22°С) - не менее 14 суток.

Полезную модель используют следующим образом.

Одним из известных способов подготавливают рану к имплантации: проводят санацию и туалет раны. Непосредственно перед имплантацией рану обрабатывают физиологическим раствором и осушают стерильными салфетками. Затем производят закрытие кожного дефекта путем нанесения клеточного имплантата (ЖЭК) на раневую поверхность.

Сверху на имплантат накладывают стерильную марлевую салфетку с теплым физиологическим раствором и производят бинтование. Первую перевязку осуществляют на 4-5-е сутки после имплантации. Последующие перевязки при отсутствии признаков воспаления производят через каждые 4-5 суток. При обильном промокании повязки экссудатом перевязку производят ежедневно.

Основными критериями заживления ран являются степень уменьшения раневой поверхности и сроки эпителизации. Степень уменьшения раневой поверхности рассчитывается по методике Поповой Л.Н. (1942).

Клинический пример 1.

Больная В., 67 год, поступила в клинику с диагнозом: «Варикозная болезнь вен нижних конечностей. Хроническая венозная недостаточность нижних конечностей 3 ст., осложненная инфицированной трофической язвой нижней трети правой голени. ИБС. Атеросклеротический кардиосклероз. Гипертоническая болезнь 3 ст.

Страдает варикозной болезнью нижних конечностей более 17 лет. Три года назад образовалась язва на внутренней поверхности правой голени, которая на протяжении последнего года значительно увеличилась в размерах. Лечение традиционными консервативными методами эффекта не имело. При поступлении - трофическая язва (ТЯ) 8×6 см, общей площадью 34 см² , с обильным серозно-гнойным отделяемым. Микрофлора была представлена в виде антибиотикорезистентной ассоциации Staph. aureus+Pseudomonas aeriginosa.

На 6 сутки стационарного лечения, после перехода ТЯ во 2 фазу раневого процесса произведено закрытие кожного клеточным имплантатом (ЖЭК). Через 11 часов после имплантации, больная отмечает значительное уменьшение боли, ночью спала спокойно. На 5 сутки после имплантации отмечается выраженная краевая эпителизация, значительное уменьшение количества отделяемого. На последующих перевязках отмечалась выраженная краевая эпителизация и прогрессивное уменьшение дефекта в размерах. Больная выписана на 16 сутки после имплантации. ТЯ зажила на 19 сутки.

Клинический пример 2.

Больная С., 59 лет, поступила в клинику с диагнозом: «Посттромбофлебитическая болезнь нижних конечностей. Хроническая венозная недостаточность левой нижней конечности 3 ст., осложненная инфицированными трофическими язвами нижней трети левой голени».

Пациент считает себя больной в течение 7 лет, когда на фоне перенесенного острого тромбофлебита стали появляться язвы на коже нижней трети левой голени. Язвы заживали после амбулаторного лечения. В июле 2008 года вновь появились язвы по передненаружной поверхности нижней трети левой голени. Больная до октября 2008 года лечилась амбулаторно. От проводимого лечения отмечалось некоторое оживление грануляций и уменьшение боли в язве. Заживление не наступило. При поступлении в стационар у больной на передненаружной поверхности левой голени, в нижней ее трети имеются две ТЯ общей площадью 19,5 см, до 0,5 см глубиной, выполненные гнойно-некротическими. Микрофлора была представлена в виде Staph. Aureus в монокультуре. В окружающих язву тканях определялись явления перифокального воспаления.

В течение 7 дней больной проведен курс комплексного консервативного лечения. В результате лечения удалось добиться очищения раны, купирования воспаления вокруг раны, однако существенного уменьшения раны не наступило.

На 8 сутки стационарного лечения, после перехода ТЯ во 2 фазу раневого процесса произведено закрытие кожного клеточным имплантатом (ЖЭК). На 2 сутки после имплантации, полностью исчезли зуд и жжение в области язвы, которые сохранялись после традиционной терапии. Во время первой перевязки, через 5 суток, отмечена краевая эпителизация, на поверхности ТЯ видна нежная блестящая пленочка, свидетельствующая об образовании неоэпителия. На последующих перевязках отмечалась выраженная краевая эпителизация и прогрессивное уменьшение дефекта в размерах. На 15 сутки ТЯ эпителизировались полностью. Заживление ТЯ происходит за счет выраженной краевой эпителизации.

Клинический пример 3.

Больной М. 67 лет, поступил в клинику 09.12.2008 г. с диагнозом: «Облитерирурющий атеросклероз сосудов нижних конечностей. Инфицированная трофическая язва тыльной поверхности правой стопы».

Из анамнеза выяснилось, считает себя больным в течение 4 месяцев, после травмы образовалась рана в области правой стопы, которая постепенно увеличивалась в размерах. Лечился амбулаторно и стационарно в лечебных учреждениях Москвы, без положительного эффекта. При поступлении раневой дефект правой стопы округлой формы, общей площадью 38,5 см² .

На 8 сутки стационарного лечения, после купирования местной воспалительной реакции, произведено закрытие кожного клеточным имплантатом (ЖЭК).

На 5 сутки после имплантации на поверхности трофической язвы определялась блестящая пленка, свидетельствующая об образовании неоэпителия. В дальнейшем, заживление ТЯ происходило за счет краевой эпителизации.

Клеточный имплантат для заместительной терапии дефектов кожного покрова, представляющий собой живой эквивалент кожи, содержащий подложку биоматрикса, образующую трехмерный каркас и выполненную из биосовместимого биополимера на основе коллагена, внутри которой распределены аллогенные мезенхимальные клетки человека, и сверху покрытую слоем эпидермальных кератиноцитов, отличающийся тем, что подложка биоматрикса выполнена из биополимера, выбранного из группы: коллагеновый гель, колагенновая губка или коллаген-хитозановая губка, в структуру которого включена эмульсия перфторуглеродов, а в качестве мезенхимальных клеток используют фибробробласты или мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани человека или их смесь с концентрацией клеток не менее чем 0,8·10⁵/см² имплантата.