Устройство для детекции микроорганизмов в жидкой фазе

Полезная модель относится к области измерительной техники, в частности к оптическим биосенсорам, и может быть использована для обнаружения (детекции) микроорганизмов (патогенных биологических агентов) в исследуемых образцах, переведенных в жидкую фазу. Полезная модель может быть использована при контроле объектов окружающей среды на наличие патогенных биологических агентов.

Техническим результатом является повышение информативности и быстрота выявления возбудителей особо опасных инфекций и их комплексов со специфическими антителами в жидкой фазе за счет использования оптического устройства с галогеновым источником излучения, блоком считывания информации, системами регулирования светового потока и возможностью одновременной оценки образцов микроорганизмов и их комплексов со специфическими антителами, помещенных в кюветы и микрокапилляры для увеличения зондируемого объема. 5 з.п., 3 пр., 4 ил.

Полезная модель относится к области измерительной техники, в частности к оптическим биосенсорам, и может быть использована для обнаружения (детекции) микроорганизмов (патогенных биологических агентов) в исследуемых образцах, переведенных в жидкую фазу. Полезная модель может быть использована при контроле объектов окружающей среды на наличие патогенных биологических агентов.

Известны биосенсоры, предназначенные для выявления и определения различных веществ в исследуемых пробах: определения загрязненности воды органическими веществами [1], выявления токсических соединений в воздушной среде [2], определения капролактама [3], олиго- и полисахаридов [4], тиодигликоля [5]. Указанные разработки не позволяют выявлять микроорганизмы в образцах.

Известно устройство для формирования базы данных для определения биологических агентов и химических веществ [6]. Устройство включает блок с источником когерентного поляризованного монохроматического электромагнитного излучения, рабочую ячейку для определяемого объекта, приемный блок для записи и считывания оптической информации с набором ячеек базы данных для хранения информации о спектрах комбинационного рассеяния или распределения спектральных характеристик интенсивности электромагнитного излучения в областях минимальных значений диаграммы рассеяния излучения, а также блок управления, имеющий выход на компьютер. База данных составляется из спектров неупругого рассеивания и распределения спектральных характеристик интенсивности электромагнитного излучения в зоне минимальных значений диаграммы рассеивания излучения пробы, состоящей из базовой биологической среды и исследуемого объекта. По спектральным характеристикам, занесенным в базу данных, можно контролировать наличие в организме вирусов, бактерий, токсинов, или определять чужеродные компоненты.

Известно устройство для детекции подвижных микроорганизмов в воде, содержащее источник лазерного излучения, оптически связанный с кюветой с исследуемой средой, расположенной соосно с пучком лазерного излучения, два фотоприемника, оптически связанных с кюветой, дифференциальные усилители и блок обработки и индикации [7]. Кювета выполнена в виде полого оптического волновода. С помощью указанного устройства за счет наличия двух фотоприемников, расположенных на определенном расстоянии друг от друга, регистрируют спектр флуктуации интенсивности рассеянного излучения, который различен для чисто броуновских частиц и подвижных микроорганизмов. На блок обработки и индикации детектора подается только разностный сигнал от двух фотоприемников, содержащий информацию только о динамических процессах в кювете. Данное устройство не позволяет обнаружить неподвижные, в том числе, обеззараженные различными способами, микроорганизмы.

Описанные устройства с использованием лазерного источника излучения требуют при их эксплуатации соблюдения санитарных норм и правил устройства и эксплуатации лазеров [8].

В основу полезной модели поставлена задача создания простого в использовании биосенсорного устройства для быстрого выявления возбудителей особо опасных инфекций и их комплексов со специфическими антителами в жидкой фазе.

Технический результат заключается в повышении информативности исследования за счет исследования проб различного объема (микро- и макрообъемы) и использования широкого оптического диапазона.

Технический результат достигается путем разработки оптического устройства с галогеновым источником излучения, блоком считывания информации широкого спектрального диапазона, системами регулирования светового потока для исследования образцов микроорганизмов и их комплексов со специфическими антителами, помещенных как в кюветы, так и в микрокапилляры.

Сущность полезной модели заключается в том, что предложено устройство для детекции микроорганизмов в жидкой фазе содержащее галогеновый источник излучения, оптически связанный с блоком считывания информации через два блока - регулятора светового потока, с кюветой и/или микрокапилляром с исследуемым объектом, расположеными в блоках для фиксации кювет. Каждый из блоков - регуляторов светового потока включает собирающие линзы, поворачиваемое зеркало, и на входе и выходе связан с источником излучения и блоком считывания информации, при этом вход одного из блоков связан с источником излучения, выходы - с кюветами, выход второго - с блоком считывания информации, а входы - с кюветами. Оптическая связь между двумя блоками - регуляторами светового потока осуществляется посредством оптоволоконного кабеля.

Блоком считывания информации содержит спектроанализатор широкого спектрального диапазона (от 200 до 1100 нм.).

Блок для фиксации кювет с исследуемым объектом в микрообъемах может включать держатель микрокапилляра, микрокапилляр, микрообъективы.

Блок для фиксации кювет с исследуемым объектом в макрообъемах может включать коллимирующие линзы, держатель кюветы, кювету.

Блок - регулятор светового потока выполнены с возможностью регулирования светового потока по двум независимым оптическим путям.

В заявляемой полезной модели используется один галогеновый источник излучения с широким диапазоном длин волн, обеспечивающий уровень спектрального разрешения, достаточный для лабораторных измерений, имеются два независимых пути направления светового потока от источника излучения к исследуемым образцам и от исследуемых образцов к блоку считывания информации. Образцы, поступившие для лабораторного анализа особо опасных инфекций в макрообъемах исследуются в кювете, оптически связанной с источником света и блоком считывания информации. Образцы, поступившие для лабораторного анализа особо опасных инфекций в микрообъемах исследуются в микрокапилляре, оптически связанном с источником света и блоком считывания информации, преобразующий оптический сигнал в электрический, позволяющий регистрировать три базовых спектра излучения (поглощения, пропускания, отражения) в диапазоне от 200 до 1100 нм. Конструктивными элементами полезной модели являются два регулятора направления светового потока по двум независимым оптическим путям. Регуляторы направления светового потока содержат поворачиваемое зеркало, заключенное в непрозрачный кожух, фиксаторы зеркала в двух положениях, в кожухе имеются три отверстия, расположенных в точках пересечения светового потока (падающего и отраженного) со стенками кожуха регулятора направления светового потока, в два из которых установлены разъемы для крепления оптических кабелей. Внутри кожуха расположены три собирающие линзы, расположенные на фокусном расстоянии от центра симметрии зеркала и входных (выходных) отверстий.

На фиг.1 а, б представлена блок-схема устройства, где 1 - галогеновый источник излучения, 2 - блок - регулятор светового потока, 3 - блок считывания информации, 5 -блок для фиксации кювет с исследуемым объектом (макрообъемы), 4 - блок для фиксации кювет с исследуемым объектом (микрообъемы). Блок - регулятор светового потока содержит собирающие линзы 6, поворачиваемое зеркало 7. Блок для фиксации кювет с исследуемым объектом (макрообъемы) содержит держатель кюветы 8, коллимирующие линзы 9. Блок для фиксации кювет с исследуемым объектом (микрообъемы) содержит держатель микрокапилляра 10, микрообъективы 11.

При исследовании образцов в макроколичествах (объемом более 0,5 мл) зеркало 7 фиксируется таким образом, чтобы направить световой поток на собирающую линзу 6, оптически связанную с блоком для фиксации кювет с исследуемым объектом 8. Блок для фиксации кювет с исследуемым объектом 8 с входной и выходной стороны имеет коллимирующие линзы 9 для формирования параллельного пучка светового потока и разъемы для крепления оптических кабелей. Линзы 9 и кювета 12 с исследуемым образцом расположены на одной оптической оси. Свет проходит через исследуемый образец в кювете, помещенной в блок для фиксации кювет с исследуемым объектом 8. Блок для фиксации кювет с исследуемым объектом соединен посредством оптического (оптоволоконного) кабеля 13 с блоком - регулятором светового потока 2, фокусирующим свет с помощью линзы на поверхность зеркала и направляющим световой поток к блоку считывания информации 3.

При исследовании образцов в микроколичествах (объемом 10-100 мкл) зеркало 7 фиксируется таким образом, чтобы направить световой поток на собирающую линзу 6, оптически связанную с блоком для фиксации кювет с исследуемым объектом 10 через микрообъектив 11, расположенный на фокусном расстоянии от входного отверстия микрокапилляра 14, и расположенного соосно с пучком светового потока. С выходной стороны микрокапилляра установлен микрообъектив 11, фокусирующий световой поток на выходе из микрокапилляра в оптический (оптоволоконный) кабель 13, расположенный от микрообъектива 11 на фокусном расстоянии и направляющий световой поток на собирающую линзу 6 блока - регулятора светового потока 2. Зеркало 7 блока - регулятора светового потока фиксируется в таком положении, чтобы световой поток был направлен на линзу 6, оптически связанную с блоком считывания информации 3.

Преимуществом заявляемого устройства является возможность исследования жидких образцов различного объема (от 10 мкл до 0,5 мл), содержащих микроорганизмы возбудители особо опасных инфекций и/или их комплексы со специфическими антителами как в кюветах, так и в микрокапиллярах, в широком спектральном диапазоне (от 350 до 1100 нм) за счет использования галогенового источника излучения - безопасного для персонала при эксплуатации, блока регулирования светового потока и регистрации нескольких видов спектров (поглощения, пропускания, отражения), что повышает информативность исследований, возможность адаптации к стандартному оборудованию.

Примеры использования заявляемого устройства:

Пример 1 детекции микроорганизмов в исследуемых образцах в макрообъмах.

В данном примере для исследования берут образец, содержащий клетки Yersinia pestis в концентрации 1×10 ⁹ м.к./мл, растворитель - физиологический раствор и с помощью заявляемого устройства проводят качественный спектральный анализ растворов.

Перед началом измерений в блоках - регуляторах светового потока зеркала фиксируют в таком положении, чтобы направить световой поток на тот оптический путь, на котором расположен в кювете исследуемый объект. В кювету вносят физиологический раствор и пропускают через нее световой поток, направленный от источника излучения на блок считывания информации. Блок считывания информации регистрирует опорный спектр растворителя R и сохраняет его в виде таблицы. Затем на заданном оптическом пути кювету с растворителем заменяют на кювету с исследуемым образцом (клетки Yersinia pestis) в жидкой фазе и объеме 0,5 мл. Блок считывания информации регистрирует спектр исследуемого образца S и сохраняет его в виде таблицы. Значения аналитического сигнала определяют по формуле: А=S-R, где; А - аналитический сигнал при длине волны , S - сигнал образца при длине волны , R - опорный сигнал при длине волны .

По полученным значениям проводят учет результатов.

При значениях аналитического сигнала усл. ед. и отсутствием максимумов и минимумов в аналитическом спектре в диапазоне 700-1100 нм - в образце клетки микроорганизмов отсутствуют. При значениях усл. ед. и расположением максимумов и минимумов в диапазоне 700-1100 нм - в образце присутствуют клетки микроорганизмов. С использованием заявляемого устройства по полученным аналитическим спектрам можно определять присутствие микроорганизмов в образцах.

На фиг.2 графически отображены значения аналитического сигнала исследуемого образца и растворителя.

Пример 2 детекции растворимых антигенов Y. pestis, и Vibrio cholerae в исследуемых образцах в микрообъмах.

При наличии исследуемого образца в малых количествах (менее 0,5 мл.) исследования проводят с использованием другого оптического пути. В блоках - регуляторах светового потока зеркала фиксируют в таком положении, чтобы направить световой поток на оптический путь, на котором расположен микрокапилляр.

Исследуемые образцы и соответствующий растворитель вносят во взаимозаменяемые микрокапилляры, и с помощью заявляемого устройства проводят качественный спектральный анализ растворов. Исследования проводят аналогично примеру 1. При значениях усл. ед. и отсутствием максимумов и минимумов в аналитическом спектре образца в диапазоне 450-950 нм - в образце растворимые антигены микроорганизмов отсутствуют. При значениях усл. ед и расположением максимумом и минимумов в диапазоне 450-950 нм - в образце присутствуют растворимые антигены микроорганизмов.

На фиг.3 графически отображены значения аналитического сигнала исследуемого образца и растворителя, отражающие наличие указанных антигенов в исследуемых образцах и их дифференциальные отличия по спектральным характеристикам. С использованием заявляемого устройства по полученным аналитическим спектрам можно определять присутствие антигенов микроорганизмов в образцах.

Пример 3 детекции и определения микроорганизмов в исследуемых образцах в макрообъмах с использованием специфических антител.

Детекцию микроорганизмов осуществляли аналогично примеру 1.

Для определения микроорганизмов используют образец 1, содержащий клетки Y. pestis в концентрации 1×10 ⁹ м.к./мл и образец 2, содержащий клетки F. tularensis в концентрации 5×10⁹ м.к./мл, образец 3 - контроль антител к Y. pestis, образец 4 - контроль клеток Y. pestis. В образцы 1 и 2 вносят специфические антитела (иммуноглобулины чумные агглютинирующие) в рабочем разведении. В качестве отрицательных контролей используют препарат иммуноглобулинов чумных агглютинирующих в рабочем разведении (образец 3) и препарат взвеси микробных клеток Y. pestis без специфических антител (образец 4). Образцы инкубируют в течение 1 ч при температуре 37°С. Исследуемые образцы вносят в кюветы поочередно и через них пропускают световой поток от источника излучения к блоку считывания информации. Вычисляют значения аналитического сигнала A, образцов и соответствующих отрицательных контролей аналогично примера 1 и осуществляют учет результатов. Определяют стандартное отклонение отношений значений A отрицательных контролей к значениям A исследуемых образцов. При значениях стандартного отклонения >2 - в исследуемом образце выявлен микроорганизм, специфически взаимодействующий с используемыми в исследовании специфическими антителами. При значениях стандартного отклонения 2 - в исследуемом образце не выявлен микроорганизм, специфически взаимодействующий с используемыми в исследовании специфическими антителами. С помощью заявляемого устройства по полученным аналитическим спектрам можно определять вид микроорганизмов в образцах при наличии соответствующих специфических антител.

На фиг.4 графически отображены значения аналитического сигнала исследуемых образцов 1, 2, 3 и 4, отражающих различие спектральных характеристик при наличии и отсутствии специфического взаимодействия антител с клетками микроорганизмов.

Таким образом заявляемое устройство позволяет осуществлять детекцию цельных клеток микроорганизмов и их антигенов, а также определять вид микроорганизма при использовании специфических антител с помощью спектрального анализа без применения меченных реагентов.

Источники:

1. патент на полезную модель РФ 73975, кл. G01N 33/18, 2008.

2. патент на полезную модель РФ 64381, кл. G01N 33/48, H04R 9/00, 2007.

3. патент на полезную модель РФ 70661, кл. C12N 1/00, 2008.

4. патент на полезную модель РФ 66815, кл. G01N 27/26, 2007.

5. свидетельство на полезную модель РФ 30994, кл. G01N 30/74, 2003.

6. патент РФ 2269116, кл. G01N 21/01, A61N 5/00, G01N 33/487, 2006

7. патент РФ 2143487, кл. С12М 1/34, 1999.

8. Санитарные нормы и правила устройства и эксплуатации лазеров. СанПиН 5804-91, М., 1991.

1. Устройство для детекции микроорганизмов в жидкой фазе, включающее галогеновый источник излучения и блок считывания информации, оптически связанные, по крайней мере, с двумя кюветами с исследуемым объектом через, по меньшей мере, два блока-регулятора светового потока, при этом вход одного из блоков связан с источником излучения, выходы - с кюветами, выход второго - с блоком считывания информации, а входы - с кюветами, причем каждая из кювет расположена на независимом оптическом пути, а одна из них представлена микрокапилляром.

2. Устройство по п.1, отличающееся тем, что блок-регулятор светового потока содержит поворачиваемое зеркало с фиксаторами в двух положениях, заключенное в непрозрачный кожух с отверстиями, внутри которого расположены три собирающие линзы.

3. Устройство по п.1, отличающееся тем, что оптическая связь между двумя блоками-регуляторами светового потока осуществляется посредством оптоволоконного кабеля.

4. Устройство по п.1, отличающееся тем, что блок считывания информации содержит спектроанализатор широкого спектрального диапазона (от 200 до 1100 нм).

5. Устройство по п.1, отличающееся тем, что галогеновый источник света используют в диапазоне от 350 до 1100 нм.

6. Устройство по п.1, отличающееся тем, что кювета и микрокапилляр с исследуемым объектом расположены в блоках для фиксации кювет.